慢性乙型肝炎患者外周血Th17細胞比例和IL-17表達水平的臨床意義

丁慶莉，唐古生，賀錚雯，沈 茜，秦陽華

(第二軍醫大學附屬長海醫院實驗診斷科，上海 200433)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型病毒性肝炎是我國發病率較高的疾病。在感染HBV的大部分成年人中，表現為一種急性、自限性的肝臟炎癥，病毒負荷的急劇下降，長久的保護性體液和細胞免疫，但在另一部分受染的成年人和大多數經垂直傳播而致病的患者中，持續的病毒感染會最終導致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)[1]。然而 HBV 在機體持續性感染致慢性肝炎發生的病理機制尚未完全闡明。HBV是一種非細胞毒性病毒，當其進入機體后常引起一系列復雜的免疫反應，而機體產生的免疫應答的強弱又與HBV感染所致的不同臨床結果密切相關。在這一系列免疫應答中，細胞免疫應答是決定HBV感染機體后轉歸的最重要因素。輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)是近幾年發現的輔助性T細胞(CD4+T細胞)新的功能亞群，主要通過分泌大量的白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)來發揮生物學效應。目前已證實Th17細胞是急性或慢性炎癥環境中重要的效應細胞，在自身免疫性疾病、炎癥反應、腫瘤等的發生、發展中均發揮著重要的作用。至今，有關Th17細胞與HBV致肝臟慢性免疫性炎癥關系的研究在國內外已見少量報道[2-3]，研究結果均提示Th17細胞可能在病毒性肝炎慢性化過程中具有重要作用?；谏鲜鲈?，本研究擬對臨床不同疾病程度CHB患者和健康人外周血Th17細胞及其效應分子IL-17的水平進行檢測，分析這些變化與患者HBV DNA載量、肝臟損傷標志物等的關系，旨在進一步證實Th17細胞在CHB慢性免疫炎癥損傷過程中的作用。

材料和方法

一、研究對象

隨機選取2007至2008年在長海醫院感染科住院或門診治療的93例CHB患者，男68例，女25例，平均年齡(43±15)歲，其中輕度21例、中度37例、重度35例，診斷依據2005年修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”標準[4]。所有患者沒有并發丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人類免疫缺陷病毒感染和自身免疫性肝炎。28名健康者均為長海醫院健康體檢者，其中男17名，女11名，平均年齡(29±8)歲，無心、肝、腎等器質性疾病，亦無乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人類免疫缺陷病毒感染和自身免疫性疾病。本研究經長海醫院醫學倫理委員會批準，每位受試對象都簽署了知情同意書。

二、標本采集

采集CHB患者血液標本時，有17例接受了核苷類抗病毒治療，11例未接受任何治療，其余均僅接受保肝降酶治療，均未接受甾體類藥物治療。以無菌方式采集各試驗對象晨起空腹靜脈血，乙二胺四乙酸抗凝血5 mL用于流式細胞儀檢測細胞成分分離;不抗凝血5 mL，血清用于檢測肝功能、HBV DNA、IL-17 等。

三、外周血Th17細胞和輔助性 T細胞(T helper cell 1，Th1)細胞的流式細胞儀檢測

取乙二胺四乙酸抗凝血 100 μL，用 100 μL含10%小牛血清的RPMI-1640培養液(Gibco公司)混合后接種于96孔培養板(Costar公司)，同時加入終濃度為50 ng/mL的佛波醇酯(Sigma公司)、1 μg/mL離子霉素(Sigma 公司)和 1 μL/mL布雷菲德菌素 A(Becton Dickinson公司)。在37℃、5%CO2培養箱刺激培養5 h。收集體外刺激活化的外周血，用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)洗滌2次。加入5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-抗人CD4(eBioscience公司)，室溫避光溫育30 min。加入1 mL紅細胞裂解液(BD公司)室溫作用10 min，洗滌。加入固定穿膜劑500 μL(eBioscience公司)，室溫作用1 h，洗滌。分別加入5 μL藻紅蛋白(phycoerythin，PE)-抗人 IL-17(eBioscience公司)、5 μL 別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)-抗人γ干擾素(interferon-gamma，IFN-γ，eBioscience公司)和同型對照抗體，室溫作用30 min，洗滌后立即用FACSCalibur流式細胞儀(BD公司)檢測。以CD4+T細胞設門，至少計數20000個細胞，以CellQuest軟件分別IL-17和 IFN-γ表達陽性細胞占CD4+T細胞的比例。

四、外周血CD4+T細胞的分離和刺激培養

采用無柱免疫磁珠細胞分選外周血CD4+細胞，試劑盒為 RosetteSep(加拿大 STEMCELL公司)，方法為抗體標記和免疫密度離心負篩選法，具體步驟:取5 mL抗凝全血，加250 μL CD4+T細胞富集試劑后混勻，室溫作用20 min，用等量PBS進行稀釋并混勻。在另一試管內加入適量淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技公司)，將處理好的標本沿管壁緩緩疊加于分層液上，形成清晰界面。置水平離心機中，400×g離心20 min。用滴管直接吸出CD4+T細胞層，加入4倍量以上的 Hank’s液，充分混勻，300×g離心10 min。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液配制細胞懸液，將細胞懸液調整到106/mL。取樣經FITC-抗人CD4抗體染色后流式細胞儀檢測純度，代表性結果見圖1，純度＞95%進行下一步試驗。按100 μL 2×105/孔的細胞接種96孔培養板，同時加入終濃度為1 μg/mL CD3和2 μg/mL CD28功能性抗體(eBioscience公司)，37℃、5%CO2孵箱刺激培養5 h進行細胞總RNA抽提，培養72 h收集上清液進行酶聯免疫吸附試驗(enzymelinked immunoserbent assay，ELISA)檢測。

圖1 外周血分選CD4+T細胞經抗CD4-FITC抗體標記后流式細胞術檢測結果

五、血清和培養上清液IL-17水平的檢測

采用ELISA檢測，試劑盒購于eBioscience公司，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

六、血清HBV DNA和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)的檢測

采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測患者血清HBV DNA水平，試劑盒購自深圳匹基生物工程公司。采用速率法檢測血清ALT，試劑盒購于科華生物工程公司，儀器為日立7600型全自動生化分析儀。

七、實時熒光定量PCR檢測IL-17和維甲酸相關孤兒核受體(RAR-related orphan nuclear receptor C，RORC)mRNA 表達

取1×106個經刺激或未刺激CD4+T細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提細胞總RNA，逆轉錄采用 TaKaRa PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)進行。再使用 SYBR?Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)于Light-Cycler定量PCR儀(Roche公司)進行實時熒光定量PCR。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)mRNA表達量為內參照，根據待檢基因和內參照基因擴增的循環數Ct值，按照公式相對值 =2-ΔΔCT計算出標本中待檢基因相對于內參照基因的相對含量。引物序列采用Primer Premier 5.0軟件設計，IL-17上、下游引物序列:F-TGTCCACCATGTGGCCTAAGAG;R-GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA。RORC上、下游引物序列:F-ACCTCACCGAGGCCATTCAG;R-TAGGCCCGGCACATCCTAAC。GAPDH上、下游引物序列:F-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;R-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

八、統計學方法

結 果

一、CHB患者外周血Th17細胞比例

與正常對照組[(0.62±0.58)%]相比，CHB患者外周血CD4+IFN-γ－IL-17+T細胞(Th17細胞)的比例[(1.89±1.46)%]明顯升高(P ＜0.05)。隨著疾病的加重，Th17細胞的比例也隨之上升。重度組、中度組和輕度組外周血Th17細胞的比例分別為(2.75 ±2.89)%、(1.75 ±1.58)%和(1.24 ±0.98)%，重度組 Th17 細胞的比例顯著高于中度組、輕度組和正常對照組(P＜0.05)，見圖2、圖 3(a)。CHB 中度組 Th17細胞的比例也顯著高于正常對照組(P＜0.05)。然而，中度組Th17細胞的比例與輕度組、輕度組與正常對照組間差異均無統計學意義(P＞0.05)。同時，本研究還觀察了CHB患者外周血CD4+IFN-γ+IL-17－T細胞(Th1細胞)的比例變化及與疾病嚴重度的關系。結果顯示，各組間Th1細胞占CD4+T細胞的比例差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2、圖3(b)。

圖2 流式細胞術檢測不同疾病程度CHB患者和正常對照組外周血Th17細胞和Th1細胞的比例

圖3 不同疾病程度CHB患者與正常對照組外周血Th17細胞和Th1細胞的比例變化

二、CHB患者外周血純化CD4+T細胞IL-17和核轉錄因子RORC mRNA表達水平的變化

未經刺激的CD4+T細胞IL-17和RORC mRNA表達水平各組間差異無統計學意義。然而，CD4+T細胞經抗CD3和抗CD28單抗刺激后，CHB重度組IL-17和RORC mRNA表達水平明顯高于輕度組和正常對照組(P＜0.05)，且IL-17 mRNA表達在中度組與正常對照組間也存在差異，但CHB重度組與中度組之間、輕度組與正常對照組之間的差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖4。

三、CHB患者血清和CD4+T細胞培養液IL-17水平的變化

各組間IL-17水平差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖 5(a)。隨后，測定經純化的CD4+T細胞刺激后的培養液的IL-17水平。與正常對照組相比，CHB患者CD4+T細胞刺激后的培養液中IL-17水平顯著升高(P＜0.05);且隨疾病嚴重程度的增加，IL-17的表達水平亦隨之增加。CHB重度組CD4+T細胞刺激后的培養液中IL-17的水平為(4535.69 ±1857.31)pg/mL，明顯高于中度組[(2472.01 ±1139.43)pg/mL]、輕度組[(1664.38 ±468.20)pg/mL]和正常對照組[(1421.17 ±471.16)pg/mL](P ＜0.05)，見圖5(b)。雖然CHB中度組IL-17水平稍高于輕度組和正常對照組，但差異無統計學意義(P＞0.05);輕度組和正常對照組之間也無差異(P＞0.05)。

圖4 不同疾病程度CHB患者和正常對照組外周血純化CD4+T細胞經功能性抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激后IL-17和RORC mRNA的表達水平

圖5 不同疾病程度CHB患者與正常對照組血清和外周血純化CD4+T細胞經功能性抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激72 h后培養液的IL-17表達水平

四、CHB患者外周血Th17比例與肝臟損傷的關系

CHB患者外周血Th17細胞比例與血清ALT水平呈明顯正相關(P＜0.01)，見圖6(a)，與血清 HBV DNA載量無相關性(P＞0.05)，見圖6(b)。

圖6 CHB患者外周血Th17細胞與血清ALT水平及HBV DNA載量的相關性分析

討 論

肝臟慢性炎癥及繼發性纖維化是CHB的特征。既往認為CHB患者機體清除病毒能力降低，致使HBV可在體內持續存在，導致HBV感染慢性化的免疫機制與Th1和Th2免疫應答失調有關。CHB患者體內的Th1細胞及其免疫應答降低，IFN-γ和IL-2等細胞因子減少，造成Th1/Th2細胞比例失衡，直接影響了細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、自然殺傷(natural killer，NK)細胞和B細胞功能的正常發揮。本研究發現CHB組外周血Th1細胞比例與正常對照組無明顯差異，且與疾病的嚴重程度也無關系，表明HBV感染慢性化不是單一因素作用的結果，還存在其他的免疫機制。近來，大量的研究已證實Th17細胞參與了多種肝臟疾病的發生機制，在酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、原發性膽汁性肝硬化等疾病中，Th17細胞發揮了誘導固有免疫應答、中性粒細胞趨化激活、產生炎癥反應等作用，在對肝臟的損傷及疾病的進展中也均起到重要作用[5-6]。同時，有文獻報道Th17細胞不僅可以上調抗凋亡分子，促進被病毒感染的細胞存活，而且可以抑制CTL對靶細胞的破壞，延長病毒持續感染的時間[7]。

有關CHB疾病過程中Th17細胞的變化、與疾病的關系等研究國內外已有一些報道，但試驗結果卻不盡一致。楊波等[8]發現，CHB組和HBV相關慢加急性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)組患者外周血Th17細胞頻率均顯著高于健康對照組，ACLF組又顯著高于CHB組患者。ACLF患者外周血Th17細胞頻率與國際標準化比值和終末期肝病模型評分均呈正相關，而CHB患者外周血Th17細胞頻率與ALT水平呈正相關，與HBV DNA載量無關。Qi等[9]的研究也得到相似的結果，ACLF患者外周血Th17細胞頻率和RORC mRNA表達水平顯著高于CHB組，而CHB組則顯著高于健康對照組。然而，Zhang等[10]發現CHB患者外周血增加的Th17細胞頻率與ALT水平及HBV DNA載量均呈正相關。林振忠等[11]也發現CHB患者Th17細胞的頻數明顯高于健康對照組，但與總膽紅素、直接膽紅素和ALT無相關性。本研究結果顯示CHB患者外周血Th17細胞比例明顯高于正常對照組，且隨著疾病的加重，Th17細胞的比例也隨之上升，表現為重度組Th17細胞比例明顯高于中度組、輕度組和正常對照組，中度組Th17細胞比例也顯著高于正常對照組。為了進一步明確CHB患者外周血Th17細胞比例的檢測結果，我們還對Th17細胞分化特異性核轉錄因子RORC mRNA的表達水平進行了檢測，所獲的結果完全佐證上述發現。升高的Th17細胞比例是否與肝臟損傷存在一定的關聯?我們發現CHB患者外周血Th17細胞的比例與血清ALT水平呈明顯正相關，而與血清HBV DNA載量無相關性，這與楊波等[8]的報道完全一致。Ye等[12]已證實，CHB患者肝內Th17細胞數量與肝臟炎癥活動度呈正相關，該報道也是對本研究結果的有力支持。各文獻報道結果有差異，原因可能與CHB患者病例的入選條件不同有一定關系。在本研究和楊波等的報道中均將CHB按疾病嚴重程度進行分組，其中重度組的病例數均﹥30例;而在林振忠等[11]的報道中均為CHB病例，如均為輕度患者，就較難觀察到外周血Th17細胞比例與ALT變化的關聯性。

IL-17是Th17細胞分泌的特征性炎性細胞因子，具有廣泛的細胞靶點，可誘導其他炎性細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶的表達，參與中性粒細胞趨化，引起炎性細胞浸潤和組織損傷[5，13]。國內外文獻報道，CHB、肝硬化、原發性肝癌和慢性肝功能衰竭患者血清IL-17和外周血單個核細胞IL-17 mRNA水平均比正常對照顯著升高，在CHB和肝硬化患者的肝組織中IL-17的表達也明顯增多[8，10-12，14]。然而，這些結果并未獲得一致的支持，一些研究發現CHB患者血清IL-17水平與正常對照者比較無明顯差異[15-16]。本研究結果也顯示CHB患者血清IL-17水平與正常對照者比較無明顯差異。但分析試驗對象純化CD4+T細胞刺激后的培養液時發現，CHB患者CD4+T細胞刺激后的培養液中IL-17的水平明顯高于正常對照者，且隨疾病嚴重程度的增加而增高。試驗對象純化CD4+T細胞經功能性抗CD3和抗CD28單克隆抗體模擬T細胞抗原受體激活CD4+T細胞時，CHB尤其是CHB重度和中度組患者CD4+T細胞趨向于分化更多的Th17細胞，致培養液中IL-17的水平高于正常對照組和CHB輕度組。關于CHB患者血清中IL-17檢測結果的差異，我們認為可能與Th17細胞在血循環中所占比例甚少，及CHB患者多存在T細胞免疫功能抑制有關。

綜上所述，本研究的結果提示CHB患者體內增高的Th17細胞可能是造成肝臟炎癥、促進肝細胞損傷的主要原因之一，并與CHB的重癥化密切相關。調節性T細胞從CD4+T細胞分化而來，在分化中所需的部分細胞因子與Th17細胞比較類似，然而生物學功能卻存在一定的拮抗。若能增加未治療患者病例數，按治療與否和不同治療方案分組，并做治療前后相關指標的比較，則可分析不同治療方案對相關指標的影響，以期探討可用于評價治療效果的指標。如果在本研究中能夠同時分析調節性T細胞的比例及相關轉錄因子、效應分子等的變化，將有助于更全面地了解CHB患者的機體免疫狀態。外周血Th17細胞比例升高可否作為CHB患者疾病進展的標記?Th17細胞是否可成為治療CHB的一個新靶點?哪些因素驅動或參與了CHB患者Th17細胞的分化?這些問題均有待于進一步探索。

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