RP-HPLC-熒光法測定大鼠海馬組織中5種氨基酸類神經(jīng)遞質

白 鈺，張 莉，馬曉麗，孔 彬，李新霞，李新宇

(1.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011;2.石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832002;3.新疆醫(yī)科大學分析測試中心，新疆 烏魯木齊 830011;4.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

氨基酸類神經(jīng)遞質主要包括興奮性氨基酸[如谷氨酸(glutamate，Glu)、天門冬氨酸(aspartate，Asp)]和抑制性氨基酸[如甘氨酸(glycine，Gly)]兩大類。這些神經(jīng)遞質主要分布于哺乳動物的腦組織中，起著維護腦內正常生理功能的關鍵作用[1]。因此，定量測定腦組織中這些氨基酸神經(jīng)遞質的含量對研究神經(jīng)系統(tǒng)生理[2]、腦血管病具有重要的應用價值。

目前，生物樣品中的氨基酸含量測定多采用高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜和毛細管電泳等[3-4]。柱前衍生HPLC法由于其高度的選擇性和快速性成為藥物和臨床樣品中氨基酸分析的首選方法。目前，常用的衍生試劑主要有鄰苯二甲醛(OPA)[5]、異硫氰酸酯(PITC)[6]、丹磺酰氯(DNS-Cl)[7]等，6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺氨基甲酸酯(AQC)是Waters公司開發(fā)出的一種專利氨基酸衍生試劑，具有快速、高效、穩(wěn)定的衍生特點，已被廣泛應用于食品中氨基酸含量的監(jiān)測，但對生物樣本中氨基酸的檢測未見報道。

由于腦內氨基酸含量較低，因此我們采用AQC這種新型熒光衍生試劑，運用柱前衍生反相(reverse phase，RP)-HPLC-熒光法測定正常大鼠海馬組織中5種氨基酸類神經(jīng)遞質的含量。

材料和方法

一、儀器與試劑

WATERS e2695型高效液相色譜儀(包括UV-2489紫外檢測器、2475熒光檢測器)，SUPELCOSIL LC-18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Sigma公司)，Empower 3 色譜工作站;BS 110S型分析天平(Sartorius公司，d=0.1 mg);SK-1型快速混勻器(金壇市醫(yī)藥儀器廠);PB-10型pH計(Sartorius公司);溶劑過濾裝置;MULTIFUGE X3R型離心機(Thermo公司);DK-S22型水浴鍋(上海精宏實驗有限公司).

氨基酸[Asp、Glu、天冬酰胺(Aspa)、谷胺酰胺(Gln)、Gly]對照品購自上海國藥集團化學試劑有限公司，純度均＞98%。

AccQ·Fluor氨基酸衍生試劑盒(美國Waters公司，包括AQC粉末2A、2B和硼酸鹽緩沖液)，乙腈和甲醇為色譜純;超純水由milli-Q超低有機物超純水機(美國Millipore公司)制備，其他試劑均為分析純。

二、實驗動物

Wistar大鼠，體重250～280 g，雌雄不拘，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供(醫(yī)動字第16-003號)。

三、色譜條件

流動相A:準確稱取7.4 g無水乙酸鈉，加水930 mL，溶解后用冰醋酸調 pH 值至6.5，然后加乙腈70 mL，混勻，用0.45 μm 濾膜過濾。流動相B:甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20。柱溫:37℃;熒光檢測，激發(fā)波長235 nm，發(fā)射波長395 nm;流速:1.0 mL/min，進樣量 5 μL。線性梯度洗脫:0 min，0%B;5 min，2%B;10 min，5%B;12 min，0%B;20 min，100%B。

四、溶液配制

1.對照品溶液配制 精密稱取5種氨基酸對照品各約10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L HCl稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為1 mg/mL的氨基酸儲備溶液，4℃冰箱放置。精密吸取各儲備液適量置同一10 mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容，混勻作為工作液，依次逐級稀釋配制系列濃度工作液，按照上述色譜條件進樣。

2.衍生試劑的配制 精密量取1 mL AccQ·Fluor 2B試劑加入裝有AccQ·Fluor衍生劑粉末的2A瓶中，加蓋密封，旋渦震蕩10 s，55℃水浴加熱10 min，直至AccQ·Fluor衍生劑粉末全部溶解，即得濃度為10 mmol/L衍生化試劑，置干燥器中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

五、氨基酸對照品的衍生化反應

精密量取混合氨基酸對照品10 μL，置于進樣襯管中，加入硼酸緩沖液70 μL和配制好的AQC試劑10 μL，在渦旋振蕩器上混勻，室溫放置1 min轉入進樣瓶，水浴加熱55℃ 10 min，直接進樣5 μL進行色譜分析。AQC與氨基酸反應的方程式見圖1。

圖1 AQC與氨基酸反應方程式

六、大鼠海馬組織預處理及衍生化反應

分別取大鼠腦海馬，稱濕重，以甲醇∶水(V/V)=1∶1的比例加入1 mL，冰浴下充分勻漿;勻漿液在4℃下13000×g低溫離心15 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾。精密吸取上清液10 μL，按照氨基酸對照品的衍生化反應步驟進行衍生化反應，進樣5 μL色譜分析。

結 果

一、氨基酸對照品及大鼠海馬組織的HPLC圖譜

混合氨基酸對照品溶液和海馬組織樣品中5種氨基酸的分離譜圖見圖2。15 min內各氨基酸均得到完全、有效的分離，峰形良好，無重合、拖尾等現(xiàn)象。

二、線性范圍和檢測限

檢測配制好的系列濃度混合氨基酸對照品溶液，以氨基酸峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，按信噪比(S/N)=3計算各氨基酸的檢測限。5種氨基酸的峰面積和濃度之間的線性關系良好，相關系數(shù)(r)為 0.99990 ～0.99997，見表1。

三、精密度、穩(wěn)定性和加標回收率實驗

取已知濃度的氨基酸混合對照品連續(xù)進樣5次，結果表明5種氨基酸峰面積的相對標準偏差(RSD)為 0.4% ～2.5%，重現(xiàn)性良好。

圖2 混合氨基酸對照品和大鼠海馬組織的HPLC圖譜

取已知濃度的混合氨基酸對照品衍生化后于第0、2、4、8、12 h 進樣分析，測得5 種氨基酸衍生物色譜峰峰面積的RSD為0.7% ～3.8%，表明海馬組織經(jīng)AQC衍生化后至少在12 h內保持穩(wěn)定。

取混合海馬組織樣品作為質控(QC)樣品，分別加入已知濃度的混合氨基酸對照品溶液，進樣分析，計算方法的回收率。5種氨基酸的加標回收率為70.27% ～128.20%，RSD 均 ＜5%，表明本法能準確測定樣品中多種氨基酸類神經(jīng)遞質。見表2。

表1 氨基酸的線性范圍及檢測限

表2 回收率測定結果

三、樣品分析

分別用建立的氨基酸衍生方法測定8只正常大鼠海馬組織中的5種氨基酸類神經(jīng)遞質，用標準曲線法分別計算各種氨基酸的含量。結果顯示大鼠海馬組織中 Asp、Glu、Aspa、Gln、Gly 的含量分別為 38.98 ± 9.66、126.42 ± 34.06、2.16 ±0.75、90.44 ±33.75、(12.95 ±4.42)μg/g。

討 論

本研究建立了適用于大鼠海馬組織中5種氨基酸類神經(jīng)遞質的RP-HPLC-熒光檢測方法。在探索該樣品測定方法時，主要考察了海馬樣品提取方法[8]，分別選用生理鹽水、甲醇、甲醇/水進行提取，高氯酸除蛋白后進行衍生反應。經(jīng)過對比，發(fā)現(xiàn)直接用1∶1的甲醇/水既可以達到提取作用，又可以同時除去組織中蛋白質，提取回收率達到80%以上。因此樣品制備最終選擇直接用等比例的甲醇/水處理后直接衍生化反應進樣分析。

在衍生試劑選擇上，本研究沒有選用文獻常用的OPA[8-12]。因為OPA需要衍生后快速進樣，且衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，在1.5 min后會快速降解，存在重復性差等情況。因此，本研究選用新的熒光衍生試劑AQC，采用梯度洗脫同時測定大鼠海馬組織中5種神經(jīng)遞質的含量。方法學研究證明AQC衍生樣品后在12 h內均符合穩(wěn)定性要求，且該方法對樣品預處理及測定有操作簡單、靈敏、色譜峰分離效果極佳、分離時間短的優(yōu)點，僅需12 min便能完成5種遞質的完全分離。綜合這些特點說明AQC優(yōu)于以往常用的OPA，適合腦內微量神經(jīng)遞質測定。

在回收率測定中，由于本研究未選用內標進行樣本萃取回收的實驗，而是利用外標法直接進行定量測定，可能會存在一定誤差，希望在以后的試驗中進一步進行深入研究。

綜上所述，本研究采用AQC衍生，RP-HPLC結合熒光檢測法對氨基酸進行分離檢測。方法學驗證結果顯示該法靈敏度高，重現(xiàn)性好，方法簡便、快速，可以為海馬組織中氨基酸類神經(jīng)遞質的分析檢測提供一種新手段，并為廣大醫(yī)務及科研工作者在臨床監(jiān)測及科研方面提供參考。

[1]李金淑，張華山，王 紅.新型熒光試劑柱前衍生高效液相色譜定量分析小鼠腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質[J].國際藥學研究雜志，2012，39(1):65-70.

[2]宋 泰.高效液相色譜法檢測小鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質[J].吉林農(nóng)業(yè)科技學院學報，2009，19(4):18-20.

[3]吳強恩，鄭力行，謝 芳，等.反相高效液相色譜熒光法測定大鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質[J].復旦學報(醫(yī)學版)，2005，32(3):355-358.

[4]宣 柳，沈佐君，何曉東，等.高效毛細管電泳測定海馬組織和腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質[J].檢驗醫(yī)學，2007，22(3):324-328.

[5]楊 晶，陸 偉，鄒滿意，等.荷肝癌小鼠血漿和腫瘤組織游離氨基酸代謝變化及其與腫瘤體積相關性研究[J].實用肝臟病雜志，2006，9(1):22-24.

[6]陽利龍，祝文兵，何周康.柱前衍生反相高效液相色譜法測定人血清中游離氨基酸[J].兒科藥學雜志，2010，16(6):25-27.

[7]張露蓉，江國榮.DABS-Cl柱前衍生RP-HPLC法定量測定血清中游離氨基酸[J].蘇州大學學報(自然科學版)，2004，45(3):65-71.

[8]張 麗，葉翠飛，沈 芊，等.高效液相熒光法測定大鼠腦內氨基酸類神經(jīng)遞質方法的改良[J].中國實驗動物學報，2011，19(5):377-380.

[9]魯燕俠，崔 佳，藺興遙，等.RP-HPLC-熒光檢測法測定小鼠腦組織中5種神經(jīng)遞質的含量[J].解放軍藥學學報，2003，19(4):262-263.

[10]郭燕舞，蔡穎謙，張世忠，等.HPLC法檢測PVS患者腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2004，3(4):251-253.

[11]李 慧，林哲絢，張 源，等.高效液相色譜-質譜-質譜法測定腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質[J].分析測試學報，2005，24(2):89-91.

[12]鄒美芬，周杏琴，欽曉峰，等.老年性癡呆患者血漿中氨基酸類神經(jīng)遞質的HPLC熒光檢測[J].分析測試學報，2009，28(8):981-984.