HBV感染者外周血Th17細胞和Treg細胞的檢測及意義

胡月明， 馬 莉， 李 虹

(貴陽醫學院附屬醫院中心實驗室，貴州 貴陽 550004)

乙型肝炎是全球廣泛流行的傳染性疾病。大量研究表明，乙型肝炎的發病機制不是單獨由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)直接引起的肝細胞損傷，而是HBV感染后引發機體細胞免疫應答和病毒共同作用的結果。因此，由細胞免疫介導的免疫損傷成為HBV感染肝細胞損傷機理研究的熱點。

輔助性T細胞亞群在免疫系統中扮演很重要的角色，可產生多種細胞因子，參與機體抗病毒的免疫應答，對病毒清除起重要作用。輔助性T細胞17(T help 17 cells，Th17)是不同于 Thl和Th2的一種CD4+T細胞亞型，因其產生大量白細胞介素-17(IL-17)而命名。最新研究表明Th17細胞可以調節和控制免疫應答[1]，其主要作用于感染組織，發揮募集中性粒細胞的生物學功能，促進炎性反應，對宿主抵抗特殊病原體發揮重要作用。與Th17細胞不同，調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)是一類具有免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群，能夠控制免疫應答的強度，減輕對機體組織的免疫損傷。Th17和Treg細胞分別起著促進與抑制炎癥反應的作用。促炎性Th17細胞與抑制性Treg細胞之間平衡狀態的打破是很多炎癥及自身免疫性疾病發病的關鍵因素之一[2]。近年來，臨床對很多炎癥性疾病，例如炎性腸病、視網膜炎和心肌炎患者體內促炎性Th17細胞與抑制性Treg細胞間平衡作用的研究都已取得突破性進展[3-5]。對 CHB患者體內 Th17細胞或Treg細胞的研究也已展開。然而，慢性HBV感染后不同臨床類型患者體內Th17細胞和Treg細胞平衡作用的研究鮮有報道。

為探討Th17細胞和Treg細胞介導的免疫反應與乙型肝炎發生發展的關系，我們選取HBV感染后肝細胞不同程度損傷的患者，檢測其外周血Th17和Treg細胞比例的變化，探討其介導的免疫反應與乙型肝炎病理損傷的可能關聯性，以期為臨床治療的監測和預后的判斷提供依據。

材料和方法

一、研究對象

收集2011年12月至2012年7月貴陽醫學院附屬醫院感染科及貴陽市第五人民院肝病科門診及住院患者116例，所有患者的診斷均符合中華醫學會肝病學分會、感染病學分會《慢性乙型肝炎防治指南2011年更新版》的診斷標準[6]，同時排除合并其他類型肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病，無既往病史。

1.無病狀乙型肝炎病毒攜帶者(asymptomatic hepatitis B virus carrier，ASC)組 ASC 患者34例，男22例，女12例，年齡28～41歲。

2.慢性乙型肝炎(chronic hepatitis Bpatient，CHB)組 CHB患者50例，男38例，女12例，年齡14～72歲。

3.肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)伴活動性肝炎組(簡稱HCC組)HCC患者32例，男21例，女11例，年齡24～51歲。所選患者近期未接受干擾素及抗病毒藥物治療，未進行放化療。

4.正常對照組 選取貴陽市第一人民醫院健康體檢者30名，男16名，女14名，年齡15～56歲。入選標準:無糖尿病、結核病、自身免疫性疾病和近期感染史;無肝炎癥狀和體征，血壓正常，心肺功能正常;乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性，抗丙型肝炎病毒(HCV)陰性。

二、標本采集

以無菌方式采集所有對象晨起空腹靜脈血10 mL，平均分為2份。一份不加抗凝劑，分離血清后用于檢測ALT、AST水平;另一份采用EDTAK2抗凝，用于細胞分離培養后流式細胞儀檢測。所有標本采集前都征得研究對象的知情同意和各醫院醫學倫理委員會的批準。

三、主要試劑及儀器

1.主要試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)-抗人CD3抗體、藻紅蛋白花青苷7(PECy7)-抗人CD8抗體、藻紅蛋白(PE)-抗人IL-17抗體、抗人CD69抗體、Treg Cocktail、PECy7-抗人 IgG1 抗體、PE-抗人IgG2a抗體、破膜劑(perm2)、紅細胞裂解液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購于美國BD Bioscience公司。RPMI 1640培養基(Lonza Bio Whittaker);離子霉素(ionomycin，IO)、(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA)、莫能霉素均購于美國Sigma公司。ALT和AST檢測試劑盒購自德國Siemens公司。

2.儀器 FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國Becton-Dickson公司);西門子1650全自動生化分析儀(德國Siemens公司)。

四、方法

1.Th17細胞的檢測 取新鮮無菌EDTA-K2抗凝全血和RPMI1640培養液各250 μL混勻，分別加入2.5 μL PMA(終濃度 50 ng/mL)、5 μL 離子霉素(終濃度 1 μg/mL)和 0.8 μL 莫能霉素(終濃度1.7 μg/mL)，置于37 ℃、5%CO2刺激培養5 h。取培養后全血細胞100 μL分別加入熒光素標記單克隆抗體 CD3-FITC 20 μL、CD8-PECy75 μL，室溫避光孵育30min。加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗滌。加入固定破膜劑1000 μL，室溫破膜后PBS洗滌。再加入20 μL抗人IL-17-PE抗體，室溫避光孵育，PBS洗滌后立即上流式細胞儀機檢測。同時進行同型陰性對照處理。以前向角(FSC)對側向角(SSC)圈出淋巴細胞群，以CD3+和CD8+細胞設門，從中圈出CD3+CD8－細胞，選擇CD3+CD8－IL-17+細胞群，使用IL-17同型對照調節電壓及補償，即得出Th17細胞占外周血CD4+淋巴細胞的比例。

2.Treg細胞的檢測 取新鮮無菌EDTA-K2抗凝全血100 μL，再加入 Treg cooktail試劑20 μL，室溫避光孵育，裂解紅細胞，PBS洗滌。立即上流式細胞儀機檢測。同時進行同型陰性對照處理。以FSC對SSC圈出淋巴細胞群，從中圈出CD4+CD25+細胞群，再圈出CD4+CD25+CD127low細胞，以CD25為同型對照調節電壓及補償，記錄Treg細胞占外周血CD4+淋巴細胞的比例。

3.流式細胞術(FCM)分析 以BD FACSTM7-Color Setup Beads和BDTMCytomter Setup Tracking Beads調整流式細胞儀，啟動FACSCanto軟件，使儀器處于最佳工作狀態。采用FACSDiva軟件檢測及分析。

4.血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平檢測 采用西門子1650全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平，嚴格按照試劑操作說明書進行。

五、統計學方法

結 果

一、各組血清ALT及AST水平分析

HBV感染者及正常對照組血清ALT及AST水平檢測結果見表1。

表1 HBV感染者及正常對照組血清ALT、AST水平分析(，U/L)

表1 HBV感染者及正常對照組血清ALT、AST水平分析(，U/L)

ALT AST正常對照組組別 例數30 ＜40 ＜50 ASC組 34 ＜40 ＜50 CHB 組 50 184.5 ±40.9 197.3 ±49.7 HCC組32 425.1 ±87.1 499.5 ±78.4

二、HBV感染者外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞比例變化

與正常對照組外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞比例比較，ASC組、CHB組、HCC組3組均明顯降低(P＜0.05、P ＜0.01)。與 ASC 組患者外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞比例比較，CHB組及HCC 組明顯降低(P ＜0.05、P ＜0.01)。見表2。

表2 HBV感染者和正常對照組外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞檢測結果(，%)

表2 HBV感染者和正常對照組外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞檢測結果(，%)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 ASC 組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01

細胞組別 例數 C D 3+T細胞 C D 3+C D 4+T 30 68.23 ±8.68 33.41 ±6.45 A S C 組 34 66.63 ±8.53* 31.63 ±5.01*C H B 組 50 62.05 ±9.82*# 27.80 ±6.89＊＊#H C C 組 32 59.9 ±10.54＊＊## 23.61 ±8.52＊＊##正常對照組

三、HBV感染者外周血Th17細胞和Treg細胞比例的變化

與正常對照組外周血Th17細胞比例比較，ASC組稍高，但差異無統計學意義(P＞0.05);CHB組、HCC組明顯升高(P＜0.01)，且高于ASC組(P＜0.05、P ＜0.01);HCC 組患者外周血 Th17細胞比例高于CHB組(P＜0.05)。外周血Treg細胞的比例變化趨勢與Th17細胞相同，見表3、圖1。

HBV感染者外周血Th17細胞和Treg細胞呈正相關(r=0.327，P ＜0.01)。正常對照組 Th17/Treg比值最低，ASC組稍高，但二者之間差異無統計學意義(P＞0.05);CHB組和HCC組均明顯高于正常對照組(P ＜0.05、P ＜0.01);HCC 組明顯高于ASC組和CHB組(P＜0.05)，見表3。

表3 各組外周血Th17細胞和Treg細胞比例檢測結果比較()

表3 各組外周血Th17細胞和Treg細胞比例檢測結果比較()

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 ASC 組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01;與 CHB 組比較，▲P ＜0.05

比值正常對照組組別 例數 Treg細胞(%) Th17細胞(%) Th17/Treg 30 7.18 ±2.28 1.13 ±0.37 0.17 ±0.16 ASC 組 34 7.72 ±2.05 1.30 ±0.28 0.18 ±0.13 CHB 組 50 9.01 ±2.92*# 2.06 ±1.15＊＊# 0.23 ±0.19*HCC 組 32 10.86 ±1.77＊＊##▲ 5.89 ±3.31＊＊##▲ 0.54 ±0.37＊＊#▲

圖1 HBV感染者及正常對照組外周血Th17細胞、Trge細胞比例

討 論

細胞免疫在機體控制HBV感染是至關重要的，其效應形式主要有2種:與靶細胞特異性結合，破壞靶細胞膜，直接殺傷靶細胞;另一種是釋放細胞因子，抵御感染、腫瘤等疾病。本研究對HBV感染患者外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞比例進行分析，結果發現CHB和HCC患者外周血CD3+、CD3+CD4+T細胞比例明顯低于ASC組和正常對照組，與文獻報道[8]結果一致。其認為CD3+CD4+T細胞生成減少。可以導致特異性抗體產生不足，不能清除游離的HBV，這可能是造成病毒在體內持續感染、患者病情加重的原因。

Th17細胞是最早參與抗感染免疫的效應性T細胞。研究表明，機體適應性免疫系統可以通過IL-17和固有免疫系統相聯系，并促進炎癥反應過程。為探究HBV感染后Th17細胞與乙型肝炎病情的關系，本研究對不同HBV感染階段的患者外周血Th17細胞比例變化，并結合患者肝臟功能指標進行了研究。實驗結果顯示，除ASC者外，CHB組和HCC組患者外周血Th17細胞比例均明顯升高，HCC組Th17細胞比例較CHB組升高更為明顯。這些均表明HBV感染后Th17細胞在T輔助細胞中所占的比例上升，且外周血Th17細胞比例與血清ALT和AST水平呈正相關。提示HBV感染后患者體內Th17細胞參與肝細胞損傷，引起肝臟炎癥反應;并與HBV感染后肝細胞炎癥加重有關。

1995年日本學者發現，CD4+CD25+T細胞回輸之后可以抑制裸鼠多種自身免疫性疾病的發生，該細胞被命名為Treg細胞。Treg細胞能夠下調機體免疫應答的水平，發揮免疫抑制作用，控制免疫應答的強度，減輕對機體組織損傷以維持自身耐受。為探討HBV感染后Treg細胞與肝臟功能的關系，本研究也對各組實驗對象外周血Treg細胞的比例變化進行了檢測。結果顯示ASC患者外周血Treg細胞比例與正常對照組比較差異無統計學意義，而CHB和HCC患者外周血Treg細胞比例增高，與 Peng等[2]的報道一致。Stoop等[9]報道CD4+CD25+Treg細胞與HBV特異性T細胞的增殖反應有關，去除Treg細胞后，HBV特異性T細胞增殖反應增強，提示Treg細胞能抑制HBV特異性免疫反應。鄭峻松等[10]研究發現，Treg細胞對效應性T細胞的作用通過接觸機制直接作用，進行特異性免疫抑制。那么HBV感染者外周血Treg細胞比例的增高對效應性T細胞——Th17細胞是否有抑制作用呢?

為深入研究這一問題，本研究對受試者外周血Th17細胞和Treg細胞比例進行相關性分析，發現Th17細胞和Treg細胞比例的變化呈正相關(r=0.327，P ＜0.01)。究其原因可能為 HBV 感染導致患者體內效應性Th17細胞增多，為拮抗效應性T細胞對機體的損傷，抑制性Treg細胞反饋性增多。另外，Th17細胞和Treg細胞的分化發育過程中都受到TGF-β的調節。朱杰等[11]的研究結果表明CHB患者血清及肝組織中TGF-β均升高，邰伯軍等[12]也證實 HCC患者體內 TGF-β顯著增高。因此，本研究中CHB和HCC患者外周血中Th17細胞和Treg細胞的比例同時增高也可能是體內TGF-β升高，促進其分化的結果。

Th17細胞和Treg細胞具有共同的起源，相互構成復雜的作用，形成一個網絡。Th17細胞和Treg細胞之間平衡狀態的打破可能是很多炎癥性疾病及自身免疫性疾病發生和發展的一個關鍵因素。本研究發現在所有受試者中正常對照組Th17/Treg比值最低，在HBV感染患者中隨著肝細胞炎癥的加重Th17/Treg比值逐漸升高。進一步表明盡管HBV感染后外周血中Th17細胞和Treg細胞的比例均同時升高，但是其升高的幅度是不一致的;隨著肝細胞炎癥的加重，外周血Th17細胞比例的升高更為明顯，導致Th17細胞和Treg細胞平衡度破壞。我們認為HBV感染患者外周血Th17細胞比例增高與肝細胞炎癥損傷加重可能互為因果，這也是患者病情進一步發展的因素之一。

綜上所述，HBV感染后隨著疾病的發生、發展，外周血Th17細胞和Treg細胞比例明顯增高。由于Th17細胞比例增高更為明顯，使其與Treg細胞構成的網絡平衡被打破，機體趨向于Th17細胞所介導的炎癥反應，造成肝細胞損害，參與疾病的發生、發展。因此，外周血Th17細胞和Treg細胞比例的檢測可作為HBV感染后指導臨床免疫治療的指標。

[1]Awasthi A，Kuchroo VK.Th17 cells:from precursors to players in inflammation and infection[J].Int Immunol，2009，21(5):489-498.

[2]Peng G，Li S，Wu W，et al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection[J].Immunology，2008，123(1):57-65.

[3]葛 婷，唐志鵬，王 亮，等.Th17/Treg失衡與炎癥性腸病的關系[J].世界華人消化雜志，2010，18(7):689-694.

[4]林 松，伍偉鋒.Th17細胞及其在心肌炎中的作用[J].國際心血管病雜志，2009，36(3):154-156.

[5]Liu X，Yang P，Lin X，et al.Inhibitory effect of cyclosporin A and corticosteroids on the production of IFN-gamma and IL-17 by T cells in Vogt-Koyanagi-Harada syndrome [J].Clin Immunol，2009，131(2):333-342.

[6]中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華肝臟病雜志，2011，19(1):13-24.

[7]Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al.IL-17 and Th17 cells[J].Annu Rev Immunol，2009，27:485-517.

[8]鄭源海，周艷貞，林元峰，等.慢性乙型肝炎患者外周血T、B淋巴細胞變化與其HBV-DNA的水平相關性探討[J].實驗與檢驗醫學，2010，28(6):584-585.

[9]Stoop JN，van der Molen RG，Kuipers EJ，et al.Inhibition of viral replication reduces regulatory T cells and enhances the antiviral immune response in chronic hepatitis B[J].Virology，2007，361(1):141-148.

[10]鄭峻松，吳 軍，易紹萱，等.CD4+CD25+Treg細胞調節T細胞的作用機制分析[J].第三軍醫大學學報，2003，25(21):1881-1884.

[11]朱 杰，杜文波，高潤平，等.慢性乙型肝病患者肝組織和血清TGF-β1的測定及臨床意義[J].中國實驗診斷學，2010，14(7):1073-1075.

[12]邰伯軍，姚登福，邱歷偉，等.肝癌組織TGF-β1和IGF-Ⅱ表達水平與HBV復制關系[J].現代醫藥衛生，2007，23(18):2691-2693.