不育患者精漿中性α-1，4-糖苷酶活性與精液參數及精子透明質酸酶活性的關系

馬曉萍，高曉勤，楊燕平，楊 喆

(1.遵義醫藥高等專科學校，貴州 遵義 563002;2.貴陽醫學院組織胚胎學教研室，貴州 貴陽 550004)

精漿中性 α-1，4-糖苷酶(alpha-1，4 glycosidase，α-1，4-G)來源于附睪，由附睪上皮分泌，是附睪功能的特異性酶及標志酶[1]。常規精液分析(routine semen analysis，RSA)一直是評價男性生育力的主要實驗室手段，但僅依靠其結果來預測男性生育狀況是不全面的。精漿中性α-1，4-G可間接反映附睪的功能及對精子各種參數的影響。精子透明質酸酶(hyaluronidase，HYD)是一種重要的存在于精子頂體的酶，是受精過程中的關鍵酶之一。我們分析了不育患者精漿中性α-1，4-G活性與RSA參數、HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)的關系，以探討其間的相關性。

材料和方法

一、對象

正常生育組12名，均為有生育能力的男性自愿獻精者，年齡24～40歲。不育組52例，選自貴陽醫學院附屬醫院生殖檢驗中心就診患者，年齡24～40歲，均為婚后正常性生活2年以上不育(排除女方不育原因)，無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史，體檢未發現有明顯睪丸、附睪及輸精管異常。精漿中性α-1，4-G活性參考區間按文獻[2]界定。根據精漿中性α-1，4-G活性檢測結果將不育患者分為中性α-1，4-G活性正常組(簡稱酶活性正常組)與中性α-1，4-G活性異常組(簡稱酶活性異常組)。

二、主要儀器及試劑

Anke-GL-16 G-Ⅱ型高速冷凍離心機(上海安亭儀器廠)，SPX-150C型恒溫恒濕箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，Sartorius BS2103型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，偉力WLJY9000彩色精子質量檢測系統(北京偉力新世紀科技發展有限公司)，Mias攝影圖象分析系統(上海天程科技有限公司)，精漿中性α-1，4-G定量檢測試劑盒(酶法，深圳華康生物醫學工程有限公司)。

三、方法

1.精液常規分析 禁欲3～7 d后手淫或取精器取精液于干燥消毒量杯內，置37℃水浴箱內液化。按照世界衛生組織(WHO)的精液分析標準[3]進行分析。

2.精漿中性α-1，4-G活性及HYD活性檢測 精液以500×g離心10 min，分離上層精漿，置－20℃ 凍存備用。采用酶法檢測精漿中性α-1，4-G活性，嚴格按試劑盒說明書操作。下層精子以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，采用改良固定底物膜法[4]進行精子HYD陽性率及HYD活性強度檢測。

四、HYD活性檢測

1.HYD陽性反應率 終止孵育后，每份孵育片于LeicaDME光學顯微鏡下均勻選取5～6個視野，隨機觀察200個精子頭部，出現周圍暈環者視為HYD陽性反應。

2.HYD活性強度 采用測微尺測量視野下每個精子頭部暈環直徑的大小，取其平均值作為判斷HYD活性強度的指標。

五、統計學分析

結 果

一、不育組和正常生育組精漿中性α-1，4-G活性、RSA參數及HYD活性比較

不育各組中精子密度、精子活動率和HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)均明顯低于正常生育組(P＜0.01)。酶活性異常組的畸形精子率明顯高于正常生育組(P＜0.01)。活性正常組精漿中性α-1，4-G活性、精子密度、精子活動率及HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)均高于酶活性異常組。見表1、圖1、圖2。

表1 不育組和正常生育組精漿中性α-1，4-G活性、RSA參數、HYD活性比較()

表1 不育組和正常生育組精漿中性α-1，4-G活性、RSA參數、HYD活性比較()

注:與正常生育組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與酶活性正常組比較，#P ＜0.01

組別 例數 精漿中性α-1，4-G活性(m U)精子密度(×10 9/L)精子活動率(%)H Y D陽性反應率(%)H Y D活性強度(μ m)畸形精子率(%)正常生育組 12 60.67 ±10.12 96.33 ±15.03 73.11 ±7.43 77.96±9.29 48.94 ±10.56 41.42 ±6.75不育組 52酶活性正常組 39 42.17 ±12.08＊＊65.09 ±22.41＊＊ 55.38 ±16.72＊＊ 44.15 ±14.39＊＊ 32.30 ±16.06＊＊51.99 ±9.92*酶活性異常組 13 14.12 ±2.91＊＊#25.21 ±17.10＊＊#29.00 ±10.07＊＊#20.90 ±8.92＊＊#10.09 ±5.41＊＊#57.21 ±7.23＊＊

圖1 正常生育組的HYD陽性反應率、HYD活性強度

圖2 酶活性異常組的HYD陽性反應率、HYD活性強度

二、精漿中性 α-1，4-G活性與 RSA參數、HYD活性相關分析

精漿中性α-1，4-G活性與精子密度、精子活動率和HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)呈正相關(r值分別為 0.816、0.890、0.872和0.847，P 均 ＜0.01);與畸形精子率呈顯著負相關(r= －0.579，P ＜0.01)。

表2 精漿中性α-1，4-G活性與精液參數、HYD活性的相關分析

討 論

附睪對于精子成熟與儲存具有重要作用。精漿中性α-1，4-G是由附睪上皮分泌。研究表明，中性α-1，4-G可通過催化精子糖原降解，為精子基本代謝、成熟、獲能、運動和受精提供能源[1]。在某些異常情況下，如附睪炎、輸精管道阻塞時中性α-1，4-G分泌減少，精漿中酶活力降低，影響精子的能源供應，影響生育[5];還有感染、不良生活習慣等[6-7]因素。精液中高濃度一氧化氮(NO)也可能是男性生育力下降的原因之一[8]。

Mahmoud等[9]報道不育癥患者精漿中性α-1，4-G活性與精子數目、精子活動力呈正相關。本研究結果也顯示中性α-1，4-G活性與精子密度、精子活率呈正相關。由此推測這種相關性可能是睪丸生精過程與該酶活性水平都受到雄性激素調節所致。本研究結果還顯示，隨著中性α-1，4-G活性降低，精子密度減少、精子活動率減弱，而畸形精子率隨之增加。這與劉睿智[10]等報道的結果不相一致，推測原因正如一些研究[11-12]所報道:精漿中性α-1，4-G活性與精子正常形態率呈正相關，這可能與附睪功能正常者精子形態成熟度較高有關;反之，精漿中性α-1，4-G活性偏低多提示附睪功能存在異常，可導致未成熟精子比例增高，并通過活性氧損傷和凋亡等機制影響精子形態和存活。說明任何可能引起附睪功能受損或精漿中性α-1，4-G活性減低的因素都會導致精液質量下降。

研究表明，生殖道感染對附睪功能有干擾作用，導致中性α-1，4-G活性降低。同時引起附睪功能障礙因素(如附睪炎、解脲脲原體感染)亦可引起精子頂體膜破損，使頂體內酶流失，導致部分患者不育[13]。精子HYD是一種存在于精子頂體的重要酶。HYD活性檢測是一種有效檢查精子受孕能力的手段[14]。本研究運用改良固定底物膜法來檢測精子頂體內HYD活性，能反映單個精子內HYD活性的強弱及陽性率高低，比以往的生化檢測法更具臨床優勢及實用性。本研究結果表明精漿中性α-1，4-G活性與HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)呈正相關，且正常生育組HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)明顯高于不育各組。說明精漿中性α-1，4-G活性可影響頂體內酶活性，精漿中性α-1，4-G活性低下可能是導致男性不育的主要原因之一。

綜上所述，精漿中性α-1，4-G活性可以影響精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)，從而影響生育。因此，精漿中性α-1，4-G活性為臨床診斷男性不育、評估精子生育能力提供了一個基礎理論依據。

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