血清乳腺珠蛋白與乳腺癌的相關性及臨床意義探討

楊 超， 康 煒， 李建華， 尤 濤， 王永鋒

(西安醫學院第一附屬醫院檢驗科，陜西 西安 710077)

1996 年，Watson等[1]發現了人乳腺珠蛋白(human mammaglobin，hMAM)基因，并初步證明該基因是乳腺癌(或乳腺)細胞特異性表達基因。自hMAM發現以來，國內外學者利用各種方法，如逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫組化等檢測乳腺或乳腺癌組織以及外周血中hMAM基因的表達情況，發現hMAM基因在乳腺癌診治過程中具有重要作用[2-5]。但這些檢測方法均存在一定局限性，如RT-PCR生成的mRNA容易降解[6-7]。近年來，研究發現外周血中hMAM基因所編碼的蛋白含量則相對比較穩定[8-11]，且國內、外關于檢測血清hMAM蛋白的研究報道甚少。為此，我們采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測了乳腺癌患者血清 hMAM水平，探討hMAM與乳腺癌早期診斷以及癌微轉移早期發現的相關性。

材料和方法

一、對象

收集西安醫學院第一附屬醫院2008年6月至2011年12月住院和門診篩查患者107例，其中乳腺癌患者68例(包括浸潤性導管癌56例、混合型浸潤性導管小葉癌5例、浸潤性小葉癌3例、黏液腺癌4例)，男1例，女67例，年齡36～65歲;良性乳腺疾病患者35例(乳腺增生20例、纖維腺瘤12例、纖維性乳腺囊性病3例)，男3例，女32例，年齡35～65歲;其他癌癥患者40例(前列腺癌、胃癌、卵巢癌、直腸癌各10例)，男18例，女22例，年齡35～70歲。所有患者均有明確的病理診斷和臨床分期。68例乳腺癌患者按臨床TNM分期分為Ⅰ期(20例)、Ⅱ期(20例)、Ⅲ期(20例)、Ⅳ期(8例);按是否存在雌激素受體(estrogen receptor，ER)表達分為 ER(+)(48例)、ER(－)(20例);按是否絕經分為絕經前(36例)、絕經后(32例);按是否有腋窩淋巴結轉移分為有轉移(48例)、無轉移(20例)。以同期西安醫學院第一附屬醫院健康體檢正常女性40名作為正常對照組，年齡35～65歲。

二、試劑和儀器

hMAM ELISA試劑盒購自美國RD公司;安圖斯洗板機和安圖斯2010型酶標儀購自匈牙利Anthos公司。

三、方法

1.標本采集 所有對象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，室溫靜置20 min后2500×g離心5 min獲取血清，－70℃保存待測。癌癥患者和乳腺良性腫塊患者于術前1 d抽取血液標本。

2.血清hMAM檢測 加40 μL樣品稀釋液至各酶標包被板的樣品孔內，再加血清10 μL;封板膜封板，放入37℃溫育箱溫育30 min;揭開封板膜，棄除液體，洗板機洗板5次，拍干后每孔加酶標試劑50 μL，用封板膜封板后 37℃溫育30 min;揭開封板膜，棄除液體，重復洗板5次后，拍干后每孔加顯色劑A、B各50 μL，37℃避光顯色15 min，再加終止液50 μL。以空白為對照，450 nm波長測量吸光度(A)值。

四、統計學方法

使用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。采用受試者工作特征(ROC)曲線確定血清hMAM診斷乳腺癌的Cut-off值，計算ROC曲線下面積、敏感性和特異性。組間血清hMAM水平比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、ROC曲線對血清hMAM水平的評價

根據68例乳腺癌和75例非乳腺癌(35例良性乳腺疾病、40名正常對照者)血清hMAM水平繪制ROC曲線，其ROC曲線下面積為0.825，即診斷乳腺癌的可信度為82.5%[95%可信區間(CI):72.6% ～92.4%]。乳腺癌患者血清hMAM 的Cut-off值為8.43 ng/mL，此時hMAM 篩查乳腺癌的敏感性和特異性分別為76.5%、82.9%，見圖1。本研究以血清hMAM ＞8.43 ng/mL作為陽性結果。

二、各組血清hMAM水平及陽性率比較

乳腺癌患者血清hMAM水平及陽性率明顯高于良性乳腺疾病組、其他癌癥組和正常對照組(P＜0.05)，而良性乳腺疾病組、其他癌癥組和正常對照組之間差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 乳腺癌患者血清hMAM的ROC曲線圖

表1 各組血清hMAM水平及陽性率比較

三、乳腺癌不同分組的血清hMAM水平及陽性率比較

Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者的血清hMAM陽性率(55%、75%)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者(25%、40%，P＜0.05)，有腋窩淋巴結轉移的乳腺癌患者血清hMAM陽性率(88%)明顯高于無轉移的患者(30%，P＜0.05)，但hMAM水平差異均無統計學意義(P＞0.05)。不管乳腺癌患者血清中是否存在ER、原癌基因C-erb-2表達及是否絕經，其血清hMAM水平及陽性率均無差異(P＞0.05)。見表2。

四、不同hMAM水平區間各組人數比例統計

乳腺癌組、乳腺良性疾病組及正常對照組血清hMAM水平在8.0 ng/mL左右及之前有部分重疊，但從9.0 ng/mL之后乳腺癌組人數明顯高于其他2組;而良性乳腺疾病組和正常對照組血清hMAM水平人數大致相同。見圖2。

表2 乳腺癌不同分組的血清hMAM陽性率比較

圖2 不同hMAM水平區間各組人數比例統計

討 論

乳腺癌是女性群體中最常見的惡性腫瘤，也是當今世界女性重要的公共健康問題。在乳腺癌早期(轉移前或轉移初期)能夠得到及時診治，對于改善預后和降低死亡率至關重要[12]。當前，有一些敏感性較高的方法被用來癌癥篩查，特別是利用患者外周血檢測癌細胞和腫瘤標志物，這些方法涉及到的生物學技術包括流式細胞術、RTPCR、免疫組化、熒光定量聚合酶鏈反應(QPCR)、ELISA 等[7-8，10]。

hMAM基因是第1個應用差異篩選分離到的新的乳腺癌相關基因，定位于11q13，編碼1個相對分子質量為10000的糖蛋白，與1個上皮分泌蛋白家族中的 hCC10蛋白、rUg、rPSC3具有同源性。hMAM基因能在部分乳腺腫瘤中擴增出。Watson等[1]認為hMAM基因具有組織特異性，只在乳腺中表達。這使hMAM基因有可能成為有助于乳腺癌診斷的腫瘤標志物。Berustein等[10]和Zehentner等[11]研究發現hMAM基因表達具有乳腺特異性，可以作為一種乳腺癌標志物用于乳腺癌的診斷和微轉移的監測。

癌轉移是致使乳腺癌患者死亡的首要原因。但目前即使高分辨率的成像技術也不能檢測到腫瘤細胞的早期轉移[13]。流式細胞術、RT-PCR、ELISA等具有較高敏感性的檢測方法可以用來篩查外周血中擴散的癌細胞以及癌基因的表達。利用RT-PCR檢測血清中hMAM mRNA表達以篩查乳腺癌微轉移比較常見，但該方法也有一定的缺陷:mRNA易降解，致使血液標本不能長時間保存，而在短時間內又不能得到大量的乳腺癌患者血液標本用于較大規模的檢測、統計及分析。Berustein等[10]認為血清中的hMAM蛋白在反復冷凍、溶解的條件下亦可長時間的保存。本研究利用ELISA檢測血清中hMAM蛋白水平的變化，其方法步驟雖復雜、繁瑣，注意事項也頗多，但研究中涉及的主要環節均嚴格按照規定的方法制備試劑并進行測定，力求各個步驟操作標準化，如加樣準確、保溫處理、洗滌徹底和比色等。在此基礎上，由于ELISA中酶的高催化性產生的高反應性使測定方法達到很高敏感度的優點得到充分發揮。因此，對檢測乳腺癌患者血清中hMAM蛋白具有較高的可信性。本研究結果顯示血清hMAM對乳腺癌的診斷可信度較高，達82.5%;當Cutoff值為8.43 ng/mL時其敏感性和特異性分別為76.5%、82.9%。乳腺癌患者血清hMAM水平及陽性率明顯高于良性乳腺疾病患者、其他癌癥患者及正常對照者(P＜0.05)。乳腺癌患者血清hMAM陽性率與其臨床分期和是否有腋窩淋巴結轉移有關(P＜0.05)，而與ER、原癌基因C-erb-2表達及是否絕經無關(P＞0.05)。血清hMAM＞9.0 ng/mL的乳腺癌組人數明顯多于乳腺良性疾病組和正常對照組。以上結果說明hMAM與乳腺癌具有相關性，能用于乳腺癌的早期診斷。本研究結果顯示不管乳腺癌患者臨床TNM分期、ER是否表達、是否絕經、是否有腋窩淋巴結轉移，其血清hMAM水平均無差異(P＞0.05)。究其原因可能與hMAM在乳腺癌中出現高表達，即高特異性有關[10-11]。

綜上所述，hMAM有可能成為一種較為理想的診斷早期乳腺癌的腫瘤標志物，對乳腺癌的早期診斷及微轉移的早期發現具有重要的臨床意義。隨著研究技術的進步和人類對腫瘤的深刻認識，相信hMAM會很快地被列為臨床常用的腫瘤檢測指標，更好地指導臨床醫生對乳腺癌疾病的早發現、早診斷和早治療。

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