BioPlexTM 2200全自動免疫分析儀檢測抗環瓜氨酸肽抗體的性能評估

趙 瀛， 黃 斐， 宋斌斌， 郭 瑋， 潘柏申

(上海復旦大學醫學院附屬中山醫院檢驗科，上海 200032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種系統性、慢性自身免疫性疾病。全球近1%的人群患有此病，且以老年人居多，女性發病率明顯高于男性，約為男性的3～4倍[1-2]。由于患者在發病2年內即可出現不可逆的骨關節損傷，因此，RA的早期診斷和治療是防止關節進一步損傷，提高患者生活質量和生存率的關鍵[3-5]。

研究發現，抗環瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體對于RA的早期診斷具有較高的靈敏度和特異性[6-8]，且抗體濃度與患者關節損傷的程度[9]以及藥物治療效果[10]相關，同時抗CCP抗體能較好地區分各類非RA疾病引起的關節痛和關節炎[11-12]。因此，2009年美國風濕病學會(ACR)和歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)將抗CCP抗體作為新的RA診斷標準之一[13]。

近年來，國外已開展懸浮芯片技術檢測自身抗體[14-15]。2010年BioPlexTM2200全自動免疫分析儀(簡稱BioPlexTM2200)檢測抗CCP抗體通過了美國食品和藥物管理局(FDA)的認證。該檢測系統的主要特點包括通量高、吸樣量少、特異性高、靈活性好[16]。目前，由于國內運用該技術檢測抗CCP抗體還處于起步階段。為了了解懸浮芯片技術及其配套試劑的分析性能和臨床實際應用情況，我們對BioPlexTM2200檢測抗CCP抗體的檢測性能和初步臨床應用進行了評估。

材料和方法

一、研究對象

收集131例2012年12月至2013年1月期間至復旦大學附屬中山醫院風濕科門診就診的患者和健康體檢者的血清樣本，-80℃保存至檢測。同時排除嚴重溶血、脂血和黃疸的樣本，根據臨床診斷將樣本分為RA組、非RA疾病對照組(簡稱非RA組)和正常對照組。

1.RA組 復旦大學附屬中山醫院風濕科門診確診的RA患者65例，年齡26～89歲，診斷標準采用2009年ACR的RA診斷標準[13]。

2.非RA組 46例，年齡29～87歲。包括各類自身免疫性疾病31例(系統性紅斑狼瘡19例、血管炎5例、自身免疫性肝病2例、干燥綜合征4例、混合性結締組織病1例)和關節痛(炎)患者15例。

3.正常對照組 復旦大學附屬中山醫院體檢中心表面健康體檢者20名，年齡46～87歲。

二、儀器和試劑

所有血清樣本同時在以下2個檢測系統進行檢測。檢測時各試劑盒均在有效期內，且嚴格按照廠商規定的操作執行。

1.BioPlexTM2200 Bio-Rad公司 BioPlexTM2200及配套抗 CCP抗體檢測試劑(批號:109901)、校準品(批號:47297)和質控品(批號:47263)。檢測系統基本特征:檢測原理為流式點陣免疫發光法技術，Cut-off值為3.0 U/mL，線性范圍為0.5 ～300.0 U/mL。

2.Roche檢測系統 Roche公司 Modular E170全自動免疫分析儀及配套抗CCP抗體檢測試劑(批號:170489)、校準品(批號:170489-01)和質控品(批號:170489-01)。檢測系統基本特征:原理為電化學發光法，Cut-off值為17.0 U/mL，線性范圍為7.0 ～500.0 U/mL。

三、方法

1.精密度評估 用BioPlexTM2200檢測高、中、低3種濃度樣本，每份樣本重復測定20次，連續測定20 d，計算批內、天間的均數()、標準差(s)及變異系數(CV)，了解批內、天間不精密度。

2.線性評估 取高值混合血清與低值混合血清按照4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4 的比例進行 5點稀釋(稀釋的5點基本覆蓋了線性范圍)，充分混勻，進行復管檢測，并通過多項式回歸分析進行線性評估，從而確認最適方程，若最適方程為多項式，則通過計算最適方程與線性之間的平均線性偏倚(ADL)，與允許偏倚(5%)進行比較，從而判斷是否呈線性[17]。

3.方法學比較 用BioPlexTM2200和Roche檢測系統檢測血清抗CCP抗體水平，計算kappa值、總符合率、陽性符合率以及陰性符合率進行一致性分析。

4.臨床應用評估 用BioPlexTM2200和Roche檢測系統分別檢測RA組、非RA組和正常對照組抗CCP抗體水平。同時采用受試者工作特征(ROC)曲線分析檢測結果，通過計算其曲線下面積(AUC)、最適Cut-off值、靈敏度、特異性、陽性似然比、陰性似然比，評價RA的臨床診斷特性。

四、統計學方法

所有數據采用SPSS 16.0統計軟件進行處理。使用SPSS軟件擬合二次、三次多項式回歸方程，并將非線性系數與“0”作t檢驗得到P值，若P＜0.05即非線性系數與“0”的差異有統計學意義，判斷為非線性，否則判斷為線性;ROC曲線分析得到2種檢測系統的AUC及最適Cut-off值，采用Z檢驗比較AUC的差異;通過計算kappa值進行一致性評價，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、精密度評估

BioPlexTM2200批內精密度和天間精密度均較好，能滿足臨床應用需要。見表1。

表1 BioPlexTM 2200檢測系統精密度評估

二、線性評估

BioPlexTM2200線性驗證的5個稀釋點濃度分別為0.5、67.8、134.6、209.2、294.6 U/mL，檢測線性范圍的多項式回歸分析結果見表2。最適多項式方程擬合值與線性擬合值的ADL＜5%，該檢測系統在臨床可接受范圍內判斷為線性。

表2 BioPlexTM 2200檢測系統多項式回歸分析

三、方法學比較

2種檢測系統的檢測結果一致性分析見圖1和表3。

四、臨床運用評估

2種檢測系統的ROC曲線和診斷特性參數見圖2和表4，兩者的AUC差異無統計學意義(Z=0.42，P ＞0.05)。

表3 2種檢測系統一致性評估

圖1 2種檢測系統的Bland-Altman圖

圖2 2種檢測系統的ROC曲線分析

表4 2種檢測系統性能比較

討 論

抗CCP抗體作為RA診斷敏感且特異的指標，在RA發病的早期即可出現，而且對于疾病的進展和預后都有著重要的意義。為了滿足臨床運用需求，抗CCP抗體檢測方法在靶抗原選擇上不斷改進。2000年，Schellekens首次通過化學法固相合成含21位氨基酸的環瓜氨酸肽作為第1代檢測抗原，該方法檢測特異性約為98%，但靈敏度(41% ～68%)低于 RF[7，18-19]。2002 年，第 2 代檢測抗原開始廣泛應用于臨床。該抗原是通過篩選RA患者混合血清從而得到模擬真實構象多肽[20]，較第 1代抗原檢測靈敏度明顯提高(64.4% ～96.0%)[21]。為了進一步提高檢測性能，第3代檢測抗原也在不斷地研究中。與此同時，檢測技術的發展也帶動了檢測性能大幅度的改變。懸浮芯片技術作為新興的高通量檢測技術，其分析性能和臨床實際應用價值都受到了廣泛關注。為了解該新技術及其相應的檢測試劑盒的檢測性能和臨床應用價值，我們對BioPlexTM2200進行評估，并與Roche檢測系統進行比較。

在精密度實驗中，3種濃度的混合血清批內和天間CV值均＜10%，符合定量試劑要求，能滿足臨床應用需求。其中，中濃度血清接近醫學決定水平(Cut-off值=3.0 U/mL)，批內和天間 CV均＜5%，表明Cut-off值對判斷是否存在抗CCP抗體有較高的穩定性。BioPlexTM2200的精密度與Roche檢測系統相似[22]，且優于傳統的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[24]。由于該檢測系統的整個反應體系處于均相條件，有利于生物大分子保持其真實的空間構象，從而保證檢測結果的穩定性。

在線性評估實驗中，BioPlexTM2200在臨床可接受范圍內判定為線性，且驗證的濃度范圍(0.5～294.6 U/mL)基本覆蓋了廠商推薦的檢測范圍(0.5 ～300 U/mL)。

本研究對BioPlexTM2200和Roche檢測系統進行了一致性分析。兩者具有較高的總體符合率，且kappa值＞0.85，顯示兩者檢測結果一致性較好。這可能與2種試劑盒均采用第2代人工合成的CCP作為檢測抗原有關，以此避免了包被不同的抗原肽所引起的差異。以上結果與Wyness等[22]的研究基本相符。然而，通過分析 Bland-Altman圖，發現少數超限標本超出1.96s界限，這可能與目前臨床上使用的抗CCP抗體檢測系統沒有標準化，又缺乏國際參考物質[23]有關。因此，不同醫療部門和檢測系統之間不可避免存在一定差異，這種現狀會給臨床應用尤其是不同醫療部門之間的結果比對和資料分析帶來困擾。

在初步臨床應用研究中，本研究對各組抗CCP抗體檢測結果進行ROC曲線分析。結果顯示Roche檢測系統的靈敏度和特異性略高于BioPlexTM2200。同時，為了解 BioPlexTM2200確診及排除RA的能力，本研究計算了其似然比。該檢測系統陽性似然比＞10，對RA具有較明確的診斷價值。

本研究結果顯示131例研究對象中BioPlexTM2200和Roche檢測系統有8例抗CCP抗體結果不符。其中，7例臨床診斷為 RA，而 BioPlexTM2200檢測結果為陰性。Waterboer等[24]研究顯示，人類血清中可能存在能與BioPlexTM2200檢測試劑微珠直接結合的抗體。微珠與此類抗體結合會引起較強的非特異性背景，對結果可能產生一定的影響。1例臨床診斷為系統性紅斑狼瘡(SLE)，BioPlexTM2200檢測結果為陽性。近年來，研究發現SLE患者血清中出現抗CCP抗體概率為7% ～20%[25-26]，且抗CCP抗體的出現可能與SLE關節炎的嚴重程度相關[25]。所以，對于RA的診斷，建議結合臨床表現、影像學資料以及其他血清學指標進行聯合判斷。

由于RA患者在發病的幾年內即可出現不可逆的骨關節破壞，因此，臨床希望在發病早期即可對RA進行診斷。本研究由于資源有限，僅對病程＞2年且已確診的RA患者進行研究，未能對早期RA患者(首次癥狀出現＜1年)進行隨訪，無法進一步評估BioPlexTM2200對早期RA的診斷價值。同時，本研究未能獲取RA患者影像學資料，評價抗CCP抗體的滴度與RA患者關節浸潤程度之間的關系。因此，在早期診斷RA以及預測骨關節損傷方面，BioPlexTM2200還尚待更進一步研究闡明。

總體而言，BioPlexTM2200分析性能較好，對于RA的診斷具有一定的臨床應用價值。然而，抗CCP抗體檢測試劑的未標準化會導致不同的檢測系統結果之間存在差異，所以標準化是今后需要攻克的難題。

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