MTFHR基因多態性對腦出血的影響及對手術風險的預警

李 玻 黃 達

(三亞市人民醫院神經外科，海南 三亞 572000)

目前中西方人群引起腦出血的原因發生了變化，西方國家腦出血的病因主要是淀粉樣腦血管病(CAA)，而在我國，高血壓仍然是引發腦出血的重要因素〔1〕。近些年的研究證明血漿同型半胱氨酸(Hcy)升高是心血管疾病的危險因素之一，可調節血管內皮細胞、血小板等的活性，引發動脈粥樣硬化及腦梗死〔2,3〕。甲硫氨酸合成酶(MTHFR)是催化Hcy轉化為甲硫氨酸的主要酶類，對控制Hcy的濃度起著關鍵作用〔4〕。大多數腦出血患者往往通過手術的方式取出血腫，而手術時機成為患者預后的重要因素，如果能找到相應的參考依據選擇合理的手術時機，無疑將為腦出血患者帶來福音。本研究擬探討MTHFR的遺傳多態性、血漿Hcy濃度與腦出血患者凝血情況間的關系，為腦出血手術時機的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1對象 根據1995年全國第四次腦血管病會議制定的腦出血診斷標準并結合頭顱CT結果選擇2010年9月至2013年2月在我院住院治療的腦出血患者170例作為研究對象。所有入選患者符合以下特點：有高血壓病史，病程4～16年，根據血腫大小計算出血量在30～80 ml，手術時間均在病發2～3 h，排除既往腦出血病史、嚴重感染、肝腎等器質性疾病，排除一個月內服用維生素B12、葉酸、葉酸拮抗劑等影響Hcy濃度的藥物。

根據病發24 h手術時觀察的凝血情況將兩組患者歸為實驗組和對照組。實驗組為凝血狀況良好的患者共87例，男45例，年齡40～65歲，平均62.7歲，女42例，年齡41～63歲，平均59.2 歲；對照組為凝血狀況較差的患者共83例，男45例，年齡39～66歲，平均61.8歲，女38例，年齡42～68歲，平均61.3歲。兩組患者的年齡、性別、病程等無顯著差異，具有可比性。

1.2方法

1.2.1Hcy檢測方法 受試者術后12 h采集EDTA抗凝血3 ml，收集血漿并于2 h內利用全自動生化儀完成對血漿Hcy的檢測，測定值高于15 μmol/L 判定為高Hcy血癥。

1.2.2基因多態性檢測方法 ①基因擴增：提取白細胞基因組DNA，設計引物P1 gcgaggccggggtcgccggagggagatcc和P2ccgtccaggcagggagccaaagcagtct，擴增含有rs13306561的長度為231 bp的片段。設計引物P3 tgaaggagaaggtgtctggggga和P4aggaccgtgcggtgagagtg，擴增含有C667T的長度為246 bp的DNA片段。用PCR的方法對片段進行擴增，擴增體系：模板DNA 0.2 g,引物各0.1 pmol/L，4種dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康為世紀)1 U，體積為50 μl。反應經歷33個循環，條件：94℃變性30 s，65℃退火30 s,72℃延伸40 s。②基因分型：將PCR產物純化后送上海生工生物工程技術服務有限公司，利用Snapshot的方法進行基因分型。

1.3統計學分析方法 利用SPSS18.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1組間Hcy檢測結果分析 實驗組中高Hcy患者68例(78.16%)，對照組57例(68.68%)，組間無顯著差異(χ2=1.96，P=0.16)。

2.2基因型檢測結果 C667T和rs13306561兩個多態位點均可檢測出CC、CT、TT三種基因型。C667T位點CC、CT、TT三個基因型在實驗組中的檢出頻率為45.98%(40例)、28.74%(25例)、25.29%(22例)，在對照組中的檢出頻率為65.01%(54例)、22.89%(19例)、12.05%(10例)。統計學分析顯示三種基因型在組間具有顯著差異(χ2=7.31，P<0.05)。將TT基因型與其他基因型進行差異性比對，結果也顯示具有統計學意義，實驗組 vs 對照組：65例(74.72%)vs 73例(87.90%)(χ2=4.87，P<0.05)。說明C667T多態位點的TT基因型可能有利于凝血。

rs13306561位點CC、CT、TT三個基因型在實驗組中的檢出頻率為56.3%(49例)、29.88%(26例)、13.79%(12例)，在對照組中的檢出頻率為72.29%(60例)、19.28%(16例)、8.43%(7例)。統計學分析顯示三種基因型的組間差異不顯著(χ2=4.71，P=0.09)。將CC基因型與其他基因型進行差異性比對，結果顯示具有統計學意義實驗組vs對照組：38例(43.67%) vs 23例(27.71%，χ2=4.72，P=0.03)。說明rs13306561多態位點的CC基因型可能有利于凝血。見表1。

2.3單倍型檢測結果 綜合分析C667T和rs13306561兩個多態位點的發生情況，可出現9種單倍型，其中CC/CC、CT/CT單倍型的分布頻率具有組間差異(P<0.05)。見表1。

表1 C667T/rs13306561單倍型比較結果〔n(%)〕

3 討 論

對腦出血患者而言，目前存在兩種治療策略：(1)針對出血量低于30 ml的患者進行保守性溶血治療，(2)對出血量大于30 ml的患者進行手術治療。在手術治療的過程中存在著明顯的矛盾：施行手術時間距離病發時間越久，病人術中出血及術后二次出血的可能性越小，但血腫對患者造成的神經損傷也就越嚴重。即使是在距離病發相同時間內施行手術的患者，也存在著很大的差異。患者形成血腫的時間與其凝血能力密切相關，凝血能力越強，患者形成血腫的時間越短，就可以選擇早期手術，改善患者的預后；反之，則容易使患者的手術時間推遲，進而加重患者的神經功能損害，惡化患者的預后。

血漿Hcy水平升高是動脈硬化、動脈血栓的重要的獨立危險因素。近些年的研究發現，Hcy以及相應的衍生物可增加血小板凝血惡烷的產生，從而影響血小板的凝集。此外，Hcy還可以產生過氧化氫，干擾凝血酶和肝素的結合，并且直接激活X等凝血因子，從而促進凝血過程。當腦出血發生時，血漿中Hcy水平可能成為影響患者應激狀態下凝血能力的重要因素。然而，在本次的研究中，我們發現手術過程中凝血能力較好的實驗組和凝血較差的對照組之間Hcy水平沒有統計學差異。分析其原因，可能是由于本次取樣時間是在患者術后12 h，距離病發時間已經超過了15 h，未能反映發病過程中血腫形成及手術過程中的實時血漿Hcy水平。

MTHFR是催化Hcy代謝的關鍵酶，也是血漿中Hcy水平的關鍵決定因素。本次研究結果顯示MTHFR基因的C667T和rs13306561兩個多態位點均可檢測出CC、CT、TT三種基因型，并且MTHFR C667T位點突變(基因型TT)可能與凝血能力密切相關，rs13306561位點的CC基因型可能與腦出血傾向密切相關。此兩個多態位點可形成9種單倍型，其中單倍型CC/CC在實驗組中明顯低于對照組，說明該單倍型可能不利于早期凝血的進行。根據以上結果，我們認為C667T多態性位點的突變基因型TT可能具有促進凝血的作用，因而對于攜帶有此類基因型的患者可選擇早期手術，而rs13306561位點的CC基因型患者則應該選擇推遲手術時間。然而由于本次研究所采集的樣本量有限，本結論尚有待于在增大樣本群的基礎上進行深入的驗證。

4 參考文獻

1Mirsen T．Acute treatment of hypertensive intracerebral hemorrhage〔J〕．Curr Treat Options Neurol，2010;12(6)：504．

2楊 爽，劉春淋，李 黎,等.血漿同行半胱氨酸與高血壓及腦卒中的相關性〔J〕.四川醫學，2013;3(3)：436-7.

3Sepulveda Sanchez JM，Matia Frances R，Malinez．Salio A，etal．Homocysteine and eerebrovasculardisease〔J〕．Rev Neurol，2004;38(4)：347-58.

4張松濤，鄭 勇.同型半胱氨酸在心腦血管疾病中的臨床意義〔J〕.檢驗醫學與臨床，2013;10(5)：582-3.

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