黃芪總黃酮和黃芪甲苷對H2O2誘導的MRC-5細胞氧化損傷的保護作用

王桂芬 陳玨曉 侯正平 張鵬霞

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

氧化損傷與衰老、Alzheimer病(AD) 、腦動脈粥樣硬化〔1,2〕等密切相關，氧化應激是這些疾病致病的根本原因。研究氧化應激對基因表達的調控作用, 探索抗氧化系統對細胞的保護途徑, 對于預防、抵制這些相關疾病的發生發展以及預防衰老等有重要意義。研究表明〔3,4〕，黃芪具有抗氧化作用。但黃芪主要成分是否能有效抑制氧化應激所致的人胚肺成纖維細胞株(MRC-5)細胞損傷，尚未見報道。本研究探討黃芪總黃酮(AF)和黃芪甲苷(Astr)對MRC-5細胞氧化應激損傷的保護作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清和MEM培養基購自Hyclone公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)購于 Sigma 公司；流式試劑盒購自BD公司；鼠抗人Trx和 Ref-1單克隆抗體購自Santa Cruz公司; 山羊抗鼠IgG購于博士德生物公司； 硝酸纖維素(NC)膜、四甲基乙二酸(TEMED)、過硫酸胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、亞甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R250、小牛血清白蛋白(BSA)購于Amresco公司；Trizol、RT-PCR試劑盒購于寶生物公司。MRC-5細胞購自中國科學院上海生物學研究細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養和處理 使用含10%BSA的MEM培養基(含 100 g/ml氨芐青霉素, 100 g/ml鏈霉素)，置37℃ CO2細胞培養箱培養。取第28代對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2H2O2誘導MRC-5細胞凋亡所需濃度和時間的確定 采用 MTT 法定量檢測細胞的活性。MRC-5細胞以7×104個/ml的密度接種于96孔板。細胞分11 組：對照組常規培養細胞，空白組僅加入相同體積的培養基；8個H2O2損傷組，每組 6 個復孔，細胞培養至對數生長期后加入H2O2至終濃度分別為200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600 μmol/L，分別孵育6、12、24 h 后，加入 5 mg/mL的 MTT 液(10 μl/孔)，繼續培養4 h。丟棄孔內培養液加入 DMSO 液(150 μl/孔)。室溫下，振蕩 10 min，使用酶標儀于 570 nm 波長處檢測各孔 OD值。計算細胞存活率。細胞存活率=(OD用藥組-OD空白) / (OD對照-OD空白)

1.2.3AF、Astr和藥物濃度的確定 采用 MTT 法定量檢測細胞的活性。第一組為對照組常規培養細胞；空白組相同體積的培養基；第二組為H2O2組常規培養細胞并使H2O2的終濃度為700 μmol/L； 第三組37℃培養至細胞到對數生長期后將AF(5、10、20、40 mg/L)和Astr(5、10、20、40 mg/L)分別加入不同孔板中，加入H2O2使終濃度為700 μmol/L，繼續于 37℃培養24 h后，MTT 法檢測570 nm 波長處檢測各孔 OD值。

1.2.4RT-PCR檢測無嘌呤/無密啶核酸內切酸/氧化還原因子-1(APE/Ref-1)和Trx mRNA基因的表達 采用RT-PCR試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA。APE/Ref-1基因上游引物5′-CAAAGAGGCAGCAGGAGA -3′，下游引物5′-CAAATTCAGCCACAATCAC-3′，擴增片段長度386 bp。Trx基因上游引物 5′- ATTTCCATCGGTCCTTAC-3′，下游引物5′-CAACTGGGTTTATGTCTTC -3′，擴增片段長度461 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，上游引物5′-AATCCCATCACCATCTTCC-3′，GH IYTBXH TR ：5′-CATCACGAAACAGTTTCC-3′，擴增片段長度382 bp。PCR擴增體系：5倍緩沖液5 μl， Taq酶0.125 μl，APE/Ref-1的上下游引物(10 μmol/L)各0.25 μl，cDNA 2 μl，加雙蒸水至25 μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次，最后72℃延伸7 min，終止反應。Trx的退火溫度為48℃，其他反應條件同上。GAPDH的退火溫度為54℃，其他的反應條件同上。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并成像。

1.2.5Western印跡檢測APE/Ref-1和Trx蛋白的表達 倒掉細胞培養液，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞3次，加入裂解液在冰上裂解30 min。收集細胞離心(12 000 r/min，4℃)5 min，收集上清，用紫外分光光度計檢測蛋白濃度和純度。按蛋白含量測定結果每孔上樣 80 μg，蛋白樣品經 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)分離后, 轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上, 用含 3% BSA的TBST(10 mmol/L Tris，0.05% Tween，0.85% NaCl)對PVDF膜進行封閉，一抗是鼠來源的單克隆抗體(1∶1 000 稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗3次，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗3次。化學發光法(ECL)顯影。

1.2.6流式細胞術檢測MRC-5細胞早期凋亡情況 藥物處理細胞后，胰酶消化吹打離心，冷PBS洗細胞2次。1倍上樣重懸細胞讓細胞數為1×106/ml。取100 μl加5 μl的PE AnnexinⅤ和5 μl的7-AAD。輕柔混勻，25℃暗箱孵育15 min后加100 μl的1倍上樣緩沖液上機。實驗均重復3次。

1.2.7免疫熒光檢測8-OHdG的表達 細胞爬片，藥物處理細胞后，PBS洗3次，丙酮固定細胞15 min，PBS洗3次，用BSA封閉液覆蓋標本，37℃孵育1 h。加一抗4℃過夜，第2天37℃復溫1 h。PBS洗3次，加異硫氯酸熒光素(FITC)標記的二抗37℃避光孵育2.5 h，PBS洗3次封片鏡檢。

2 結 果

2.1MTT測定結果 800 μmol/L H2O2孵育 24 h可顯著誘導 MRC-5 細胞損傷，使細胞存活力下降至47.25%。建立了細胞氧化損傷模型。見圖1。

2.2AF和Astr對MRC-5細胞存活率的影響 Af最佳抗氧化濃度為10 mg/L，Astr為10 mg/L，其細胞存活率與模型組有顯著差異。見圖2。

2.3RT-PCR檢測APE/Ref- 1和Trx mRNA的表達情況 AF+ H2O2、Astr+ H2O2組比H2O2組APE/Ref-1和Trx mRNA表達明顯升高(P<0.01)，而H2O2組與對照組相比表達明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖1 不同濃度的H2O2作用于MRC-5細胞不同時間對細胞損傷的影響

1～4分別為AF+H2O2組、Astr+H2O2組、H2O2組、對照組；與H2O2組比較：1)P<0.01；下圖同

M：DL2000 DNA Marker

圖3 AF和Atrs對APE/Ref-1和Trx mRNA表達影響

2.4MRC-5細胞APE/Ref-1蛋白表達 H2O2使 MRC-5細胞的APE/Ref-1蛋白表達顯著降低，AF+H2O2和Astr+H2O2組促進MRC-5細胞的APE/Ref-1和Trx蛋白表達。見圖4。

2.5MRC-5細胞早期凋亡情況 MRC-5的早期凋亡率為20.700 0%±2.206 8%；AF+ H2O2組凋亡率為4.400 0%±1.931 3%；Astr+ H2O2組凋亡率為5.800 0%±1.777 6%；對照組細胞凋亡率為1.633 3%±0.896 3%。結果這兩種藥物可明顯減輕H2O2對MRC-5細胞的凋亡誘導作用(P<0.05)。

圖4 Western印跡檢測APE/Ref-1和Trx蛋白表達

2.6免疫熒光檢測8-羥化脫氧烏苷(8-OHdG)的表達 H2O2組MRC-5的8-OHdG熒光強度為0.984 6±0.150 3；AF+ H2O2組的8-OHdG熒光強度為0.568 5±0.020 5；Astr+ H2O2組的8-OHdG熒光強度為0.638 0±0.042 4；對照組8-OHdG熒光強度為0.540 0±0.129 5。藥物可明顯減輕H2O2對MRC-5細胞的氧化損傷作用(P<0.05)。

3 討 論

體外培養的細胞衰老模型,可用于闡述器官衰老內在機制,同時細胞衰老也可以被不同的應激因素誘導,包括氧化應激。H2O2是一種較強的氧化劑，能穿透細胞膜，通過Haber-Weiss 或 Fenton 反應，形成高活性的自由基如單態氧、羥自由基等活性氧簇(ROS)，ROS廣泛攻擊膜磷脂、膜蛋白、胞質蛋白和DNA,導致細胞的氧化應激損傷〔5〕。ROS攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子時,可生成氧化性加合物8-OHdG, 從而使DNA鏈空間結構改變。堿基配對時8-OHdG與腺嘌呤A配對, 導致DNA鏈G∶C→T∶A顛換。這種突變難以修復或修復極慢, 常常是ROS引起突變、誘發癌癥過程中的重要事件。因此, 8-OHdG已被廣泛用于實驗和臨床中, 參與氧化應激與病變的指標檢測與機制分析。

ROS對DNA的損傷最終產生AP位點，抑制mRNA和DNA 的合成，作為非編碼病變導致DNA突變增加。APE能控制許多轉錄因子的活性包括Fos和Jun, DNA通過催化反應切斷5′磷酸二酯鍵除去無堿基位點，毗鄰到一個AP位點。硫氧還蛋白和APE/Ref-1對正常組織細胞有抗氧化應激損傷作用，發揮細胞保護作用，使細胞免于氧化應激的損傷，APE/Ref-1的氧化還原修飾由TRX完成，后者通過直接作用使APE/Ref-1還原，并與之形成異二聚體復合物。TRX必須由胞質易位至核內才能與APE/Ref-1反應，其作用由Cys32和Cys35完成；而APE/Ref-1的靶殘基可能為Cys65和Cys93，因為它們對氧化還原敏感。紫外線、HO-均可使TRX易位。APE/Ref-1與TRX作用增強了APE/REF-1介導的AP-1和p53對DNA的特異結合，促使它們發揮轉錄因子的作用。

細胞氧化損傷時APE /Ref-1和Trx的表達降低，而Trx蛋白是非常有效的單線態氧淬滅劑和羥自由基清除劑〔6〕，修復損傷蛋白質(將二硫鍵還原為巰基)參與細胞氧化還原調節的耦聯通路〔7,8〕：NADPH-硫氧還蛋白(Trx)-APE /ref-1-氧化/還原調節的轉錄因子(AP-1、NF-κB、Egr-1、HIF-1α、HLF、Pax-5、Pax-8、p53等)，而且轉錄因子AP-1、NF-κB、P53、HIF-1激活的一些靶基因表達出刺激一些對細胞具有保護作用的蛋白質合成〔9〕。

現代藥理學研究證實，黃芪具有增強人體免疫功能、抗輻射、抗疲勞、抗炎及抗病毒等作用〔10〕，長期服用黃芪可以預防老年性動脈硬化。周鵬〔11〕研究發現黃芪處理衰老大鼠腦模型后，可使超氧化物歧化酶(SOD)活性增加，谷脫甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性也增加，丙二醛(MDA)含量降低，證明黃芪抗衰老可能是通過促進自由基的清除來完成。

本文成功地建立了H2O2導致MRC-5細胞氧化應激損傷的細胞模型；并且結果表明，AF和Astr能夠抑制氧化損傷細胞的APE/Ref-1表達降低。由此推測AF、Astr和AP可能增加了Trx的活性，進而激活APE/Ref-1，通過DNA修復作用與氧化還原作用抑制細胞凋亡來實現對MRC-5細胞保護作用。

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