Runx3和C-myc基因在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

鄭 瑋 鄒兆偉 鐘 林 黃宗海

(南方醫科大學珠江醫院，廣東 廣州 510280)

近年研究發現，癌基因和抑癌基因的表達失調與結直腸癌的發生密切相關。Runx3抑癌基因是轉化生長因子(TGF-β)轉導通路中的關鍵因子, 參與TGF-β通路對上皮細胞的負性調控, 并與細胞分化、細胞周期調控、細胞凋亡和惡性轉化有關，主要機制為啟動子區甲基化以及雜合性缺失。原癌基因myc(v-myc)最初發現于雞的逆轉錄病毒中，其在哺乳動物中的同源對應物為C-myc基因。C-myc基因與細胞生長分裂密切相關, 能調控細胞增殖、分化, 而其過度表達可誘導細胞轉化與腫瘤形成〔1〕,參與腫瘤的發生。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年5～12月南方醫科大學珠江醫院普通外科結直腸癌手術標本63例，手術切除結直腸標本后，癌組織取自腫瘤中心部位(非壞死部位)，另取腸管近端切緣(距腫瘤處≥5 cm，且經病理確認為正常組織)。作為對照組的癌旁正常組織，立即放入液氮中冷凍保存備用,手術標本術后送病理，明確診斷為癌。63例患者中男34例，女29例，年齡30～87歲，中位年齡61歲，結腸30例，直腸33例；腺癌53例，黏液癌10例；分化程度：高分化5例，中分化52例，低分化6例。Dukes分期：A期12例，B期24例，C期26例，D期1例；淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移38例。所有患者術前均未接受化療、放療及其他抗癌治療。

1.2Western印跡檢測Runx3與C-myc的表達 將約100 mg組織樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，用剪刀將組織剪成小塊，放入組織勻漿器中，與配置好的1 ml裂解液(購自凱基全蛋白提取試劑盒)充分混勻，上下勻漿15次。將勻漿后的組織及裂解液4℃離心30 min。將上清轉移至離心管中，取上清10 μl進行蛋白定量。蛋白定量后，取30 μg總蛋白經10%+二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，并通過恒壓轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉3 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜2 次，每次5 min。用抗-Runx3 抗體(1∶1 000 稀釋)，抗-C-myc 抗體(1∶1 000 稀釋),內參抗-GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。TBST 洗膜4次，每次5 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(1∶4 000 稀釋)孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min。增強化學發光法(ECL)顯色，壓片，Quantity One灰度軟件分析，得出目的基因灰度值。

圖1 Runx3在各期各分化程度的表達

圖2 C-myc在各期各分化程度中的表達

2 結 果

Runx3蛋白在結直腸癌組織中的表達(1.075 3±0.492 8)較癌旁組織(2.070 1±1.002 5)下調，C-myc蛋白在結直腸癌組織中的表達(2.240 6±0.607 1)較癌旁組織上調(1.372 9±0.472 9)(P=0.000，P=0.000)。其各自的表達在不同Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移狀態及病理分化類型差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，圖2。Runx3表達與患者性別、年齡、腫瘤病灶部位無相關性，與組織類型、腫瘤腔內直徑有相關性(P<0.05)；C-myc與患者性別、年齡、組織類型，腫瘤腔內直徑無相關性，可能與腫瘤病灶部位有相關性(P<0.05)。線性相關分析，二者的表達呈負相關(r=-0.398，P=0.001)。見表1。

表1 結直腸癌Runx3和C-myc蛋白表達與結直腸癌不同臨床病理參數的關系

3 討 論

Runx3為抑癌基因，Runx3啟動子區域的CpG島的甲基化是導致Runx3表達下調的重要原因,其活性同時可能也受到多種信號通路的影響，如磷酸化、乙酰化和泛素化降解等。Runx3抑癌機制與具有誘導生長抑制、凋亡功能的TGF-β通路密切相關〔2，3〕。研究表明〔4〕，Runx3可能是TGF-β信號傳導通路的關鍵作用靶點。在TGF-β信號傳導過程中，TGF-β與Smad形成的復合物需在Runx3蛋白的介導下完成由胞質轉入胞核內的過程，并可增強其與核內特異性靶點的結合力，共同調節相關靶基因的轉錄。Runx3表達沉默可導致TGF-β信號途徑紊亂，引起TGF-β信號失活，進而引發細胞凋亡障礙，導致腫瘤的發生。Kim等〔5〕研究結果表明，大腸癌中Runx3的表達量明顯低于正常黏膜組織，Runx3基因表達缺失與大腸癌分期有關，Runx3表達在低分化和伴有淋巴結轉移組中明顯低于中高分化和未轉移組。本實驗結果與此相符。

既然TGF-β/Smad信號通路參與了結直腸癌的發生和發展〔6〕，而Runx3蛋白是Smad信號途徑的主要靶蛋白之一〔4〕，它也應該與這些生物學行為的調節過程有關。Runx3蛋白可能通過幾個方面促成癌癥的誘導，包括細胞周期調控失調、細胞凋亡失效、細胞異常分化和血管生成異常等。

C-myc癌基因具有雙向調節作用, 既可介導細胞增殖, 又可介導細胞凋亡, 其調節方向取決于細胞接收的信號或細胞所處的生長環境。既往研究表明C-myc可激活細胞的端粒酶, 誘導細胞端粒酶的轉錄，使細胞“永生化”，從而誘導腫瘤的形成。Knies-Bamforth等〔7〕報道C-myc可促進血管內皮生長因子的表達, 促進新生血管形成，為腫瘤形成提供條件。已證實 C-myc在結直腸癌的發生中起癌基因作用〔8,9〕，陸毅〔10〕還發現C-myc基因在結腸癌組織中高度表達，癌旁正常組織中的表達明顯下降；C-myc基因的表達與結腸癌浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期密切相關，與年齡、性別、腫瘤大小、組織學類型和分化程度無關，提示C-myc基因的表達增強與結腸癌的發生發展有著密切關系。本研究結果也進一步證實了這一點。

骨形態發生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的成員，是一種多功能細胞因子，調節廣泛的生物學功能。Runx3是TGF-β和BMP介導的信號轉導通路的一部分。此通路提出了兩個平行途徑，一種為直接通過綁定Runx3、C-myc基因啟動子的結合位點，抑制C-myc的表達。C-myc基因啟動子的轉錄活性被BMP與Runx3復合物下調。另一種是通過BMP和Runx3基因轉錄，抑制β-catenin/TGF4的信號活動。BMP可抑制β-catenin，影響C-myc基因啟動子，從而影響C-myc基因的轉錄，此部分是β-連環素/T-細胞轉錄因子(β-catenin/TGF4)介導的過程。Lee等〔11〕通過研究BMP信號通路的分子基礎，檢測經BMP預處理的人類大腸癌細胞株HT-29的Runx3、C-myc mRNA和蛋白表達以及HT-29細胞凋亡率,證實BMP信號通路通過上調Runx3降低C-myc表達。本研究提示Runx3蛋白在結直腸癌組織中表達下調，C-myc蛋白在結直腸癌組織中表達上調，二者的表達呈負相關。但由于實驗條件所限，具體分子機制與作用靶點有待下一步研究。

4 參考文獻

1He C, Hu H, Braren R,etal.c-myc in the hematopoietic lineage is crucial for its angiogenic function in the mouse embryo〔J〕.Development,2008;135(14): 2467-77.

2Tan SH, Ida H, Lau QC,etal.Detection of promoter hypermethylation in serum samples of cancer patients by methylation-specific polymerase chain reaction for tumour suppressor genes including RUNX3〔J〕.Oncol Rep,2007;18(5): 1225-30.

3Smith E, De Young NJ, Pavey SJ,etal.Similarity of aberrant DNA methylation in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma〔J〕.Mol Cancer,2008;7:75.

4Kato N, Tamura G, Fukase M,etal.Hypermethylation of the RUNX3 gene promoter in testicular yolk sac tumor of infants〔J〕.Am J Pathol,2003;163(2): 387-91.

5Kim TY, Lee HJ, Hwang KS,etal.Methylation of RUNX3 in various types of human cancers and premalignant stages of gastric carcinoma〔J〕.Lab Invest,2004;84(4): 479-84.

6Ai X, Wu Y, Zhang W,etal.Targeting ERK pathway reduces liver metastasis of Smad4-inactivated colorectal cancer〔J〕.Cancer Biol Ther,2013;14(11):1059-67.

7Knies-Bamforth UE, Fox SB, Poulsom R,etal.c-Myc interacts with hypoxia to induce angiogenesis in vivo by a vascular endothelial growth factor-dependent mechanism〔J〕. Cancer Res,2004;64(18): 6563-70.

8Chen B, Zhang XY, Zhang YJ,etal.Antisense to cyclin D1 reverses the transformed phenotype of human gastric cancer cells〔J〕.World J Gastroenterol,1999;5(1):18-21.

9Bala S, Peltom?ki P.CYCLIN D1 as a genetic modifier in hereditary nonpolyposis colorectal cancer〔J〕.Cancer Res,2001;61(16): 6042-5.

10陸 毅.C-myc基因和P16基因在結腸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.中國老年學雜志,2010；30(11):1602-3.

11Lee CW, Ito K, Ito Y. Role of RUNX3 in bone morphogenetic protein signaling in colorectal cancer〔J〕.Cancer Res,2010;70(10): 4243-52.