Cripto-1、Activin-A在人肺腺癌組織中的表達及臨床意義

單楊楊 李晟磊

(鄭州大學第五附屬醫院老年病科，河南 鄭州 450052)

畸胎瘤衍生生長因子 (Cripto)-1基因屬于表皮生長因子Cripto -FRL-Criptic(EGF-CFC)基因家族成員，研究表明，Cripto-1蛋白在正常組織中低表達或不表達，但在許多惡性腫瘤中高表達，因此在一定程度上發揮著癌基因的作用。激活素(Activin)-A基因屬于轉化生長因子(TGF) 的超家族成員，大量研究證實Activin-A對多種腫瘤細胞具有抑制作用，在多數腫瘤細胞中低表達，而在正常組織細胞中高表達，在一定程度上發揮著抑癌基因的作用。本研究探討這兩種基因蛋白對腫瘤臨床治療的指導意義。

1 材料與方法

1.1材料 選擇2011年1月至2013年4月在鄭州大學第一附屬醫院胸外科手術的肺腺癌患者石蠟包埋標本47例，其中男29例，女18例，平均年齡(48.8±7.8)歲，其中無淋巴結轉移19例，有淋巴結轉移28例；按照肺癌TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期20例。結合2011年國際肺腺癌新分類標準〔1〕，47例肺腺癌均為浸潤性，具體又可分為：乳頭型20例、微乳頭型8例、實體型5例、腺泡型14例。對照組：選擇同期在鄭州大學第一附屬醫院胸外科手術切除的正常肺組織石蠟包埋標本25例，其中男11例，女14例，平均年齡(47.9±9.1)歲。

1.2免疫組化染色 染色方法按照免疫組織化學鏈霉素抗生物素-過氧化物酶(SP)法進行操作。主要試劑：兔抗人Cripto-1多克隆抗體 (英國abcam公司)；羊抗人Activin-A多克隆抗體 (美國R&D公司)；封閉用正常羊血清、生物素標記的羊抗兔二抗、生物素標記的兔抗山羊IgG、免疫組化顯色試劑盒(北京康為試劑公司)。

1.3結果判斷 Cripto-1蛋白陽性表達產物主要定位于細胞質和細胞膜中，而Activin-A蛋白陽性表達產物主要定位于細胞質中，兩者均以細胞質和(或)細胞膜中呈現棕黃色顆粒為陽性細胞。免疫組化結果評分標準：①陽性細胞數計分：每張切片于顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野，染色結果判定采用半定量加分法，即陽性細胞數<5%計0分，5%～20%計1分，21%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；②細胞染色強度計分：淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分，不著色計0分。將①和②所計分數相加，≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.4統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，免疫組化結果與臨床病理參數之間采用χ2檢驗，Cripto-1與Activin-A兩者的相關性分析采用Spearman檢驗。

2 結 果

2.1Cripto-1蛋白在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達 Cripto-1在肺腺癌組織中的陽性表達率〔72.3%(34/47)〕遠高于其在正常肺組織中表達〔12.0%(3/25)〕(χ2=23.786，P<0.05)。見圖1。

高表達 低表達 正常肺組織(陽性)

2.2Cripto-1蛋白的表達與肺腺癌各項臨床病理學特征之間的關系 Cripto-1蛋白的高表達與肺腺癌的TNM分期、淋巴結轉移及肺腺癌的主要病理組織學分型具有密切相關性(P<0.05)。Cripto-1蛋白的陽性表達在Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌組織中較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高，在有淋巴結轉移組中的陽性表達率遠高于在無淋巴結轉移組，并且Cripto-1蛋白在肺腺癌不同病理組織學分型標本中的陽性表達率也存在顯著統計學差別，其中在實體型和微乳頭型中的陽性表達率遠高于在乳頭型和腺泡型中的陽性表達率，見表1。

2.3Activin-A蛋白在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達 Activin-A蛋白在肺腺癌組織中的陽性表達率〔59.6%(28/47)〕遠低于其在正常肺組織中的表達〔92.0%(23/25)〕(χ2=17.860，P<0.05)。見圖2。

陽性 低表達 正常肺組織(高表達)

表1 Cripto-1 蛋白及Activin-A蛋白陽性表達與肺腺癌臨床病理學特征的關系〔n(%)〕

2.4Activin-A蛋白的表達與肺腺癌各項臨床病理學特征之間的關系 Activin-A蛋白的低表達與肺腺癌患者的TNM分期、淋巴結轉移及肺腺癌的主要病理組織學分型密切相關(P<0.05)。Activin-A蛋白在肺腺癌有淋巴結轉移組中的陽性表達率遠低于在無淋巴結轉移組，在Ⅲ～Ⅳ期癌組織中的陽性表達率較Ⅰ～Ⅱ期明顯降低，并且在實體型和微乳頭型中的陽性表達率明顯低于乳頭型和腺泡型(均P<0.05)，見表1。

2.5Activin-A蛋白與Cripto-1蛋白在肺腺癌中表達的關系 在Activin-A陽性表達的28例肺腺癌組織中，Cripto-1陽性表達3例，陰性表達25例；在陰性表達的19例肺腺癌組織中，Cripto-1陽性表達9例，陰性表達10例。Activin-A蛋白及Cripto-1蛋白在肺腺癌中的表達呈負相關性(r=-0.418，P<0.05)。

3 討 論

不同類型肺腺癌之間預后存在顯著差異，其中原位腺癌、微浸潤性腺癌預后好，浸潤性腺癌中貼壁型、乳頭型及腺泡型預后相對較好，而實體型和微乳頭型預后較差〔2，3〕。研究〔4〕表明，惡性腫瘤的發生與細胞周期紊亂及增殖分化失調密切相關，而腫瘤的早期階段主要為細胞過度增生，繼而細胞增生調節機制紊亂，最終導致腫瘤發生。人們認識到癌基因與抑癌基因的調節功能失衡是腫瘤發生、發展的重要因素。尋找癌基因、對相關癌基因的早期檢測及針對相關癌基因的分子靶向治療在腫瘤患者的治療中其作用越來越顯著，并且許多癌基因靶向分子已經在多種不同的腫瘤中被鑒定〔5，6〕，癌基因靶向分子也成為近些年來醫學界研究的熱點。

Cripto-1基因蛋白具有癌基因特性，它在多數惡性腫瘤中的表達陽性率大約從40%～80%不等，但對于肺腺癌中的表達卻鮮有報導。本研究顯示，肺腺癌組織中Cripto-1蛋白的高表達與肺腺癌的發生密切相關。而且Cripto-1蛋白在肺腺癌的發展、侵襲和轉移過程中發揮著非常重要的作用，Cripto-1蛋白的高表達也預示著肺腺癌的高惡性程度，預后不良。

Activin-A的信號通過ActivinⅠ型受體(Alk4)和ActivinⅡ型受體(ActRⅡ/ⅡB)來傳遞〔7〕。Activin-A是一種復雜的具有多種生物功能的激素，在人體多種正常組織細胞中表達，它的功能包括調節細胞的生長發育、生殖、分化、參與機體炎癥反應、損傷修復甚至參與調節腫瘤細胞生長和凋亡的過程〔8〕，因此被認為是一種抑癌基因。激活素信號轉導通路的紊亂則可使細胞逃避由此介導的生長抑制作用，從而導致腫瘤的發生。在以往的多項研究中發現，Activin-A可抑制多種腫瘤細胞系的生長，但對于Activin-A與肺腺癌的相關性研究國內外資料卻罕有報道。本研究顯示出在肺腺癌組織中Activin-A蛋白的低表達與肺腺癌的發生密切相關，Activin-A蛋白的高表達預示著腫瘤的預后較好，因此在腫瘤的發生上Activin-A扮演著抑癌基因的作用。另外提示Activin-A蛋白的低表達在肺腺癌的發展和轉移中同樣起著非常重要的作用，是肺腺癌預后不良的標志。本研究還提示這二者在肺腺癌的發生、發展中起著相互抑制的作用，相關研究表明，Cripto-1的促癌基因作用是通過調節Actvin信號轉導通路來實現的。Cripto-1蛋白的過表達可阻礙細胞內Activin-A 信號的轉導，Cripto-1可直接與Alk4結合，抑制Actvin-A與Alk4結合，在腫瘤細胞中，Activin的信號阻斷是由于形成了Cripto-1、Activin及 ActivinⅡ型受體(ActRⅡ)復合物〔9〕，繼而阻斷了Activin抑制腫瘤細胞增殖的作用。此外，Cripto-1與Actvin-AB可直接結合從而達到阻斷Actvin-A抑制腫瘤細胞生長的作用。用Cripto-1的抗體抑制劑與ActvinA結合可明顯抑制腫瘤細胞的生長，其抑制率可達到70%〔10〕，這為進一步研究腫瘤細胞的靶向治療提供了指導方向。針對Cripto-1研究最多的腫瘤生物靶向治療有：Cripto-1的反義寡核苷酸研究、RNA干擾技術及腫瘤單克隆抗體研究等。其中反義寡核苷酸研究在動物模型中發現不僅能有效抑制多種腫瘤細胞株生長，還能降低腫瘤組織內微血管的密度。RNA干擾技術是近年來研究出的較反義寡核苷酸技術更有望應用于臨床治療的方法。目前國外研究最多的是針對Cripto-1分子結構的兩個重要CFC和EGF研制出的單克隆抗體。針對Activin-A和Cripto-1信號轉導通路的Cripto-1/ActRⅡ阻斷劑是最新研究的潛在的腫瘤靶向治療新方法，代表藥物阿蘭內酯通過阻斷Cripto-1與ActivinⅡ型受體結合，阻斷Cripto-1信號的傳導來發揮抗腫瘤作用，相關資料顯示出該藥物在體外培養的人結腸腺癌細胞中顯示出特異性抗腫瘤增殖的功能，而對正常細胞幾乎沒有毒性〔9〕。此外，直接應用Activin-A治療在一些腫瘤中能夠起到促進腫瘤肌肉組織萎縮的作用，在小鼠體內進行Activin-A全身治療可起到促進腫瘤組織肌肉萎縮和細胞凋亡的效果〔11〕。上述研究雖然因為多種局限性暫不能應用于人體內研究，但為今后的臨床腫瘤靶向生物治療指出了新的方向。

4 參考文獻

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11Thissen JP,Loumaye A.Role of Activin A and Myostatin in cancer cachexia〔J〕.Ann Endocrinol(Paris)，2013；74(2):79-81.