阿司匹林對宮頸癌Hela細胞凋亡及增殖的影響

王 蓓 邢邯英 李建立 褚兆蘋 賈利剛 秦 英

(河北省人民醫院婦產科，河北 石家莊 050051)

腫瘤的發生、發展涉及多基因及其他多種因素的共同參與，是細胞增殖與凋亡機制紊亂的結果。抑制腫瘤細胞增殖，誘導其發生凋亡在腫瘤的預防和治療過程中發揮著重要的作用。目前，越來越多的研究表明，非甾體類抗炎藥物阿司匹林能夠通過抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡而降低胃癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發生，對腫瘤具有一定的預防和治療作用〔1，2〕。本研究探討阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞增殖及凋的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細胞(河北醫科大學第四醫院科研中心)；阿司匹林(Sigma公司)；RPMI-1640培養基(Hyclone公司)；小牛血清、胰酶DMSO等(Gibco公司)；鼠抗人Bcl-2、抗人Bax和羊抗鼠IgG-HRP二抗(Santa Cruz生物工程公司)；Hochest33258(美國Sigma-Aldrich 公司)；WST-1(瑞士 Roche 公司)。

1.2細胞常規培養 接種宮頸癌Hela細胞于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基中，于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養。細胞貼壁生長約90% 融合時，以0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次。

1.3分組 實驗分為對照組和阿司匹林干預組。①對照組：取對數生長期的Hela細胞以5×105/瓶的密度接種于25 cm2培養瓶中，24 h后更換含1% 乙醇的RPMI-1640培養基，然后繼續培養48 h；②阿司匹林干預組：細胞接種24 h后更換含有阿司匹林濃度分別為1.0、5.0、10.0 mmol/L 的RPMI-1640培養基(阿司匹林純品溶于無水乙醇中，過濾除菌，再用RPMI-1640培養基分別配置成終濃度為1、5、10 mmol/L，無水乙醇最大濃度為1%)，再置于37℃，CO2含量5%飽和濕度的培養箱中48 h。

1.4細胞增殖檢測

1.4.1顯微鏡觀察 接種對數生長期的Hela細胞到6孔板，每孔1×105個，培養24 h后，以不同濃度的阿司匹林(1.0、5.0、10.0 mmol/L)處理細胞48 h，鏡下觀察其生長狀況。

1.4.2水溶性四氮唑(WST-1) 檢測 取對數生長期的Hela細胞接種到 96 孔板 ，每孔0.1×104個，接種細胞24 h后加入不同濃度的阿司匹林(1.0、5.0、10.0 mmol/L)，分別于作用后24、48、72 h每孔加入10 μl細胞增殖試劑WST-1，繼續培養2 h，然后用酶標儀檢測 450 nm 波長各孔的光密度值(D450)，每組設立 3 個復合孔。 計算增殖抑制率。 增殖抑制率(%)= 〔1-觀察組D450值/對照組D450值〕×100%。

1.5細胞凋亡檢測

1.5.1Hochest 33258染色 不同濃度的阿司匹林(1.0、5.0、10.0 mmol/L)處理Hela細胞48 h后吸盡培養液，加入固定液，用PBS洗2遍。加入Hoechst 33258染色液，染色5 min。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.5.2TUNEL染色 接種1×105個細胞于6孔板中，培養過夜后用設定濃度的 阿司匹林處理細胞48 h收獲細胞。4%多聚甲醛液固定30 min，過氧化氫孵育、牛血清白蛋白封閉、抗體孵育、SABC法染色，封片后光學顯微鏡下觀察、計數、拍照。

1.6Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 細胞經藥物處理后24、48 h,收集細胞加入細胞裂解液,冰上放置30 min,10 000 r/min離心1 min,保留上清,考馬斯亮藍染色酶標儀測定蛋白含量,加入上樣Buffer沸水中水浴5 min使得蛋白變性,在10% SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離蛋白,再將其轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜,分別加鼠抗人Bcl-2、抗人Bax抗體一抗作用后,羊抗鼠IgG-HRP反應2 h,TBST洗滌2遍,ECL顯影壓膠片。

2 結 果

2.1細胞增殖情況 顯微鏡觀察：與對照組相比，處理48 h后，阿司匹林濃度在1 mmol/L時，腫瘤細胞生長速度變慢；5 mmol/L時，可以看到大量變圓的凋亡細胞；10 mmol/L時，幾乎看不到貼壁的完整細胞(圖1)。WST-1檢測：與對照組相比，處理24 h，高劑量組(10 mmol/L)細胞數目明顯減少；處理48～72 h 后，中劑量組(5 mmol/L)對細胞的生長已有明顯抑制作用，高劑量組(10 mmol/L)細胞出現凋亡，少見存活細胞(見表1)。

2.2Hochest 33258染色鏡下觀察凋亡現象 見圖2。阿司匹林作用于細胞48 h后，各劑量組均出現凋亡征象，表現為細胞核內可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態變化，并且隨著阿司匹林濃度的增高凋亡現象越明顯。

對照組

1 mmol/L

5 mmol/L

10 mmol/L

對照組 1 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L

2.3TUNEL染色鏡下觀察凋亡現象 細胞經不同濃度阿司匹林作用48 h后，TUNEL法檢測結果顯示不同濃度的阿司匹林可誘導細胞均發生凋亡，其表現為TUNEL染色陽性，即細胞核被染成顏色深淺不同的棕黃色，并且隨著劑量的增加效應越明顯，見圖3。

表1 WST-1測定阿司匹林劑量和時間依賴性抑制Hela細胞的增殖

對照組

1 mmol/L

5 mmol/L

10 mmol/L

2.4Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 不同濃度阿司匹林作用24 h后,Hela細胞抑凋亡基因Bcl-2蛋白表達減少,促凋亡基因Bax蛋白表達增加,作用48 h后Bcl-2蛋白表達明顯減少,Bax蛋白表達顯著增加(見圖4)。

圖4 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

近年來人們發現阿司匹林等具有防治腫瘤的作用，其誘導腫瘤細胞凋亡的相關機制主要分為依賴于環氧化酶(COX)-2 途徑和非COX-2 途徑兩大方面〔3〕。研究認為，COX-2 的活性增高可以引起前列腺素 E2(PGE2)和Bcl-2 的高度表達，降低 E-鈣黏蛋白的活性而抑制細胞凋亡、刺激血管生成，從而導致腫瘤的發生，并增加惡性腫瘤的侵襲力〔4〕。而阿司匹林可通過抑制環氧化酶使花生四烯酸至前列腺素的代謝通路受阻，對腫瘤的發生、發展起到化學預防和治療的作用〔5〕。在非 COX-2 的途徑中，研究表明，阿司匹林可通過調節 B 細胞淋巴瘤/白血病(BCL) 家族，C-myc，P 53，Caspase 等癌基因和抑癌基因〔6〕，影響細胞凋亡信號的傳導而抑制腫瘤細胞的生長，促進其發生凋亡。

Donowitz等〔7〕首次報道了長期服用阿司匹林的人群較普通人群結直腸癌的發病率明顯降低，此后數項流行病學調查、動物實驗和體外實驗都得出了類似的結論。Moysich等〔8〕通過臨床調查發現，規律服用阿司匹林可有效降低肥胖婦女子宮內膜癌的發病率，Kutuk等〔5〕研究發現，阿司匹林能夠以劑量依賴的方式抑制體外子宮內膜腺癌細胞株Ishikawa的生長，細胞凋亡是這些變化的機制之一。細胞凋亡已經成為重要的生物學事件，也是抗腫瘤治療的一大研究熱點和新靶向〔10〕。此外，近年來許多文獻報道，DNA損傷因子包括化療藥物和放療等，在損傷DNA的同時還可以引起腫瘤細胞在G2/M期阻滯，甚至誘導細胞凋亡〔11〕。

本研究結果顯示，一定濃度的阿司匹林可以抑制人宮頸癌細胞株Hela增殖，并隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用也逐漸增強；且通過凋亡特異性細胞核染色等檢測證實，阿司匹林在抑制人宮頸癌細胞增殖的同時還誘導細胞發生凋亡。本研究結果提示，阿司匹林能有效抑制宮頸癌細胞的生長和增殖，誘導其發生凋亡，有望成為臨床上治療惡性腫瘤的重要手段。

綜上所述，阿司匹林處理宮頸癌Hela細胞后,可以影響Bcl-2基因家族的調控,上調促進凋亡的Bax基因表達同時下調抑制凋亡Bcl-2基因,使得線粒體參與的凋亡途徑被活化,最終激活細胞凋亡過程中最重要的終末執行酶Caspase-3,引起細胞凋亡〔12〕，可能為阿司匹林誘導Hela細胞凋亡的主要機制。

4 參考文獻

1Leung AM,Redlak MJ,Miller TA.Aspirin-induced mucosal cell death in human gastric cells:role of a caspase-independent mechanism〔J〕.Dig Dis Sci,2009;54(1):28-5.

2Xiang S,Sun Z,He Q,etal.Aspirin inhibits ErbB2 to induce apoptosis in cervical cancer cells〔J〕.Med Oncol,2010;27(2):379-87.

3Lee SK,Park MS,Nam MJ.Aspirin has antitumor effects via expression of calpain gene in cervical cancer cells〔J〕.J Oncol,2008(2);2008:285-374.

4Kutuk O,Basaga H.Aspirin inhibits TNFα- and IL-1-induced NF-κB activation and sensitizes Hela cells to apoptosis〔J〕.Cytokine,2004;25(2):229-37.

5Kutuk O,Basaga H.Aspirin prevents apoptosis and NF-κB activationinduced by H2O2in Hela cells〔J〕.Talor﹠Francis healthsciences,2003;12(10):1267-76.

6Rajnish A.Cyclooxygenase-1 is overexpressed and promotes angiogenic growth factor production in ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2003;63(3):906-11.

7Donowitz M,Pauker SG.Evaluation for colon cancer in patients with occult fecal blood loss while taking aspirin:a Bayesian viewpoint〔J〕.Med Decis Making,1982;2(2):147-60.

8Moysich KB,Baker JA,Rodabaugh KJ,etal.Regular analgesic use and risk of endometrial cancer〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005;14(12):2923-8.

9Hector A,Arango MD.Aspirin effects on endometrial cancer cell growth〔J〕.Obstet Gynecol,2001;97(3):423-7.

10Morré DJ,Morre DM.tNOX,an alternative target to COX-2 to explain the anticancer activities of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDS) 〔J〕.Mol Cell Biochem,2006;283(1-2):159-67.

11朱慧明，吳 鐵，崔 燎.阿司匹林誘導人肺腺癌細胞株SPC-1凋亡研究〔J〕.中國藥理學通報，2004；20(6)：640-3.

12Kim KY,Seol JY,Jeon GA,etal.The combined treatment of aspirin and radiation induces apoptosis by the regulation of bcl-2 and caspase-3 in human cervical cancer cell〔J〕.Cancer Lett,2003;89(2):157-66.