補中益氣湯與siRNA對肺腺癌A549/DDP細胞耐藥逆轉作用的比較

李璐璐 于 丹 王 瑩 井 歡 劉春英

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院病理教研室，遼寧 沈陽 110032)

肺癌常規應用順鉑等化療藥物治療時，常由于順鉑耐藥而影響療效〔1〕。因此，研究肺癌耐藥機制及其逆轉途徑對治療具有重要作用〔2〕。研究表明，補中益氣湯可對抗化療引起的胃腸道等不良反應，改善肺癌耐藥，提高療效〔3〕。P-gp蛋白的過度表達是腫瘤產生多藥耐藥的分子基礎，RNA干擾(RNAi)技術通過引起與其同源的mRNA特異性降解，達到抑制相應基因表達的目的。本實驗主要觀察補中益氣湯含藥血清對A549/DDP的耐藥逆轉作用及P-gp表達的影響，探討該復方藥物逆轉多藥耐藥的有關機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌耐順鉑A549/DDP細胞購自中國科學院腫瘤醫院中心細胞庫(北京)。SPF級SD 大鼠體重(200±20)g，遼寧中醫藥大學動物部提供(動物許可證號:2012-0012號)。MTT、DMSO、RPMI1640培養基購于北京鼎國;胎牛血清購于Hyclone;兔抗人P-gp及β-actin購于南京凱基；siRNA由北京鼎國公司設計合成;脂質體轉染試劑及反轉錄試劑均購于北京鼎國公司。電轉移儀購于美國Bio-Rad公司，紫外分光光度計(Q-5000)購于Quwell公司，凝膠成像分析儀購于北京市六一儀器廠，雙穩數顯電泳儀購于北京鼎國生物技術有限公司，熒光定量PCR儀購于ABI公司。

1.2方法

1.2.1制備含藥血清 根據《藥典》中規定補中益氣湯的用藥劑量(黃芪18 g，甘草9 g，人參6 g，當歸3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術9 g)，計算出大鼠等效劑量，以0.576 g/ml常規煎煮。大鼠灌胃給藥每日1次，連續3 d。末次給藥1 h后，動物麻醉狀態下，腹主動脈采血，置無菌管，靜置30分后離心，取上清，56 ℃水浴滅活，于超凈臺上過濾除菌，分裝，-20 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2細胞培養 將A549/DDP細胞接種在培養瓶中，用含10%胎牛血清培養，放置在含5%CO2，37℃飽和濕度的培養箱中保存。細胞長滿貼壁后，胰蛋白酶消化，傳代培養。含藥血清組在細胞生長至70%時更換含10%補中益氣湯含藥血清的完全培養基，繼續培養24 h后用于后續實驗，實驗用細胞均處于對數生長期。

1.2.3RNAi 根據siRNA設計原則及P-gp基因在GeneBank中的序列合成3對特異siRNA1、 siRNA2、siRNA3分別對應P-gp mRNA的3個不同部位，用NCBI網站的BLAST序列進行對比，排除同源性。P-gp1F：5′GATCC GCTGGTTGCTGCTTACATATTCAAGAGATATGTAAGCAGCAACCAGCTTTTTTA3′；P-gp1R：5′AGCTTAAAAAAGCTGGTTGCTGCTTACATATCTCTTG AATATGTAAGCAGCAACCAGCG3′；P-gp2F：5′GATCCGCTGCTTACATTCAGGTCATTCAAGAGATGACCTGAATGTAAGCAGCTTT TTTA3′；P-gp2R：5′AGCTTAAAAAAGCTGCTTACATTCAGGTCATCTCTTGAATGACCTGAATGTAAGCAGCG3′；P-gp3F：5′GATC CGGAGATAGGCTGGTGATGTTTCAAGAGAACATCACCAGCCTA TCTCCTTTTTTA3′；P-gp3R：5′AGCTTAAAAAAGGAGATAGGCTGGTGATGTTCTCTTGAAACATCACCAGCCTATCTCCG3′；0F：5′GATCCGCAGATAGGTAGGCGTTATTTCAAGAGAATAACGCCTA CCTATCTGCTTTTTTA3′；0R：5′AGCTTAAAAAAGCAGATAGGTAGGCGTTATTCTCTTGAAATAACGCCTACCTATCTGCG3′。

1.2.4RT-PCR 按照Trizol一步法分別提取各組細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增出P-gp、內參GAPDH基因片段。P-gp：上游：5'CCACTCCTCCACCTTTGAC3'；下游：5'ACCCTGTTGCTGTAGCCA3'；β-actin：上游：5'CCACTCCTCCACCTTTGAC3'；下游：5'ACCCTGTTGCTGTAGCCA3'，反應結束后，將PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外透射儀上觀察結果，以β-actin為內參照，用反應產物的吸光度與內參的比值表示P-gp基因的表達強度。

1.2.5蛋白免疫印跡試驗(Western 印跡) 分別將收集培養的3組細胞提取總蛋白，灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規電泳，轉膜，封閉，一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，在暗室用ECL發光，掃描圖像后，用Quantity One軟件測定各條帶的吸光度分析結果，采用所測的p-gp條帶與β-actin吸光度值的比值表示該蛋白的表達強度。

1.2.6免疫細胞化學法 取對數生長期的A549/DDP細胞，0.25%胰酶消化后，接種于置有蓋玻片的24孔板中，實驗分為A549/DDP空白血清組、補中益氣湯含藥血清組、siRNA處理組和陰性對照組。細胞貼壁后，A549/DDP空白血清組加入含有10%的空白血清的培養基，A549/DDP含藥血清組加入含有10%的中劑量補中益氣湯含藥血清作為培養基，siRNA處理組將細胞進行轉染后，使用空白血清作為培養基，陰性對照組正常培養。繼續培養48 h后取出蓋玻片,4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20 min，山羊血清封閉30 min，滴加一抗4 ℃在濕盒中孵育過夜。生物素標記二抗，作用30 min后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，常規處理后，封片。陰性對照以PBS代替一抗，余同上。用Quantity One圖像分析軟件進行分析，以細胞質/膜或核中出現粗細一致的棕黃色顆粒作為陽性，隨機取 5 個視野，在 400 倍高倍鏡下，計數細胞，測出陽性反應細胞的總面積(Area)和吸光度(Absorbance)，求出平均光密度(AOD)。

1.2.7按試劑盒說明進行轉染，將siRNA以200 mmol/L的終濃度接種于A549/DDP細胞培養液，孵育48 h后，搜集細胞。取對數生長期的A549/DDP細胞，按照密度為1×105個/ml，接種96孔板，每孔加液量為200 μl。分設A549/DDP組、補中益氣湯含藥血清組和siRNA組，各組均取5種DDP質量濃度:25、50、100、200、400 mg/L。繼續培養72 h后，加入濃度為5 mg/ml的MTT，20 μl/孔，孵育4 h后，加二甲基亞砜(DMSO)，150 μl /孔，靜置10 min，于酶標儀 570 nm 讀取吸光度值。根據公式：耐藥倍數RI=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50，計算出RI。

2 結 果

2.1Western 印跡 siRNA-P-gp作用后P-gp蛋白表達強度至(81.66±1.73)%(P<0.01)，補中益氣湯作用A549/DDP細胞后能夠降低其P-gp蛋白的表達強度至(85.29±2.36)%(P<0.01);與siRNA類似。見圖1。

2.2免疫細胞化學法檢測細胞中P-gp蛋白的表達 P-gp蛋白于細胞膜和細胞漿中表達較多，A549/DDP空白血清組中胞質棕黃色，深染，有大量棕黃色顆粒，表達呈強陽性；A549/DDP含藥血清組同siRNA組僅局部細胞胞質呈棕黃色，表達明顯降低，且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

1：A549/DDP空白對照組；2：陰性對照組；3：siRNA-處理組；4：補中益氣湯含藥血清組

A549/DDP空白對照組 siRNA-處理組

補中益氣湯含藥血清組 陰性對照組

2.3RT-PCR A549/DDP空白血清組mRNA表達為1，siRNA-P-gp作用后mRNA表達強度降至(32.32±0.59)%(P<0.05),補中益氣湯含藥血清作用A549/DDP細胞后能夠降低其P-gp mRNA的表達強度至(49.41±4.83)%(P<0.05)。

2.4對A549/DDP細胞的耐藥逆轉作用 將3組細胞進行藥敏實驗，經siRNA干擾P-gp mRNA及補中益氣湯含藥血清處理后，A549/DDP細胞對順鉑的IC50顯著降低，A549/DDP組、siRNA組、補中益氣湯含藥血清組IC50值分別為(36.15±0.37)、(13.24±0.15)、(17.98±0.84)μmol/L，RI分別降至2.73和2.01，具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

肺癌是世界上發病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，它的發生發展是一個復雜的多階段過程,與基因和多種分子水平變化有關，順鉑是目前臨床治療肺癌的基本藥物，肺癌細胞對 DDP 耐藥是化療失敗的重要原因之一〔4〕，研究表明，p-gp蛋白與該類藥物耐藥密切相關，其過度表達可明顯影響藥物的胞內轉運和分布,從而導致靶點藥物有效濃度下降而介導耐藥〔5〕。siRNA是一種由dsRNA介導的基因沉默過程，作為一種新的研究工具，這項技術是近年來腫瘤研究的熱點之一，可消除或減少特異基因活性，導致相應組織靶基因功能切除，從而產生靶定破壞基因的效果，特異性地抑制目的基因的表達〔6〕，具有高效性，穩定性，高度序列特異性，操作簡單等特點〔7〕。本研究結果顯示，耐藥細胞經過補中益氣湯含藥血清作用后能有效降低P-gp mRNA和蛋白的表達，提高對順鉑的化療敏感性，其機制可能與沉默P-gp后減低膜表面轉運蛋白有關。

4 參考文獻

1鄭 偉，高振華，田 欣.培美曲塞聯合卡鉑治療老年晚期非小細胞肺癌的臨床觀察〔J〕.中國老年學雜志，2008；28(5)：485-6.

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3胡 強，汪宏云，楊勇剛.補中益氣湯防治晚期肺癌化療毒副反應臨床觀察〔J〕.實用中醫藥雜志，2008；25(5):271-2.

4Loo TW,Clarke DM.Do drug substrates enter the common drug-binding pocket of P-glycoprotein through“gates” 〔J〕?Briochem Riophys Res Commun,2005;329(3):419-22.

5董 巖，趙曉紅，紀 萍.P53和LRP蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義〔J〕.青島大學醫學院學報，2003；39(4):457-8.

6Cheng JC,Moore TB,Sakamoto KM.RNA interference and human disease 〔J〕.Mol Genet Metab,2003;80(1/2):121.

7Kaelin WG Jr，Molecular B.Use and abuse of RNAi to study mammalian gene function[J].Science,2012;337(6093):421.