羅格列酮對帕金森病模型小鼠炎癥反應和細胞凋亡的影響

張 田 魏子峰 秦麗娟 周洪霞 張宇新

(河北聯合大學基礎醫學院生理學教研室，河北 唐山 063000)

目前，對帕金森病(PD)的治療仍然采用多巴胺(DA)替代療法，已知的藥物只能起到改善癥狀的作用，不能延緩疾病的進程和DA能神經元退變，而且長期服用會產生嚴重的副作用，因此急需找到有效的治療藥物。近年研究顯示，炎癥反應和細胞凋亡在PD病理過程中可能起了重要作用〔1，2〕。羅格列酮是一種常用的治療糖尿病藥物，文獻報道，在神經系統變性疾病中對神經元有保護作用〔3〕。本實驗以1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)制備小鼠模型，探討羅格列酮能否減少炎癥因子環氧合酶(COX)-2、前列腺素E2(PGE2)和凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表達，從而對DA能神經元產生保護作用，以期為PD尋找新的可能治療途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 雄性健康C57BL/6N 小鼠45只，12～14 周齡，體質量 25～30 g，清潔級，購于北京維通利華公司，自由進食，飲水，室溫(25±2)℃，單籠喂養。MPTP(Sigma，USA)、兔抗人COX-2多克隆抗體(福州邁新公司)、兔抗鼠caspase-3多克隆抗體(福州邁新公司)、兔抗鼠PGE2單克隆抗體(Cayman，USA)、預染蛋白Marker(天津灝洋生物公司)、大鼠抗酪酸羥化酶(TH)單克隆抗體(Chemicon，USA)、羅格列酮(英國葛蘭素史克公司)、UltraSensitive SP超敏試劑盒(福州邁新公司)。

1.2動物分組和模型制備 實驗動物隨機分為3組，每組15只。模型組：腹腔注射MPTP(25 mg/kg，生理鹽水溶解)，1次/d，連續7 d；羅格列酮處理組：在MPTP注射前4 h灌胃給予羅格列酮預處理(4 mg/kg)，1次/d，連續7 d；對照組：注射與模型組等量生理鹽水。

1.3組織固定、取材和切片 MPTP第7 次注射后12 h ，每組隨機取9只小鼠。腹腔麻醉后，經左心室插管用生理鹽水(室溫)灌注，再用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，迅速切取中腦黑質部位腦塊，置于4%多聚甲醛后固定48 h(4℃)，固定好的腦組織經蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，包埋后，石蠟切片機做連續冠狀切片，片厚5 μm，4℃保存備用。每組15只小鼠中，隨機取另外6只進行免疫印跡分析。小鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，分離中腦黑質部分，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，4℃震蕩30 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液，-80℃保存備用。

1.4免疫組織化學 免疫組織化學顯色采用鏈霉素親生物素-過氧化酶連接法(SP)法，步驟如下：切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，用三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)(pH 7.4±0.2)洗3次，每次5 min；組織切片進行水浴法抗原修復；降至室溫；每張切片加入過氧化氫(25 μl)阻斷內源性過氧化物酶；每張切片滴加10%正常山羊血清(25 μl)室溫孵育15 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗人COX-2多克隆抗體(1∶100)，兔抗鼠caspase-3多克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠PGE2單克隆抗體(1∶300)，大鼠抗TH單克隆抗體(1∶300)，4℃過夜；加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG，1∶150)室溫孵育20 min；加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(25 μl)室溫孵育20 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。免疫組織化學顯色數據，采用CMIAS真彩醫學圖像自動分析系統進行陽性細胞計數。各組每只動物3張腦片數值相加后取平均值。

1.5免疫印跡 蛋白定量后取4倍體積樣品緩沖液，95°C變性10 min。蛋白上樣量為每孔30 g，10% SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉移至硝酸纖維膜上，依分子量大小切取條帶，加入封閉液室溫下震蕩2 h后，取相應條帶分別加入兔抗人COX-2多克隆抗體(1∶100)，兔抗鼠caspase-3多克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠PGE2單克隆抗體(1∶300)，大鼠抗TH單克隆抗體(1∶400)，4℃過夜。室溫孵育1 h后；分別加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG，1∶500)室溫孵育1 h；加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液室溫下孵育0.5 h；DAB顯色,掃描蛋白印跡條帶，作定量分析。

1.6行為學檢測 為了測定各組小鼠行為學功能改變，本實驗采用爬桿實驗。具體方法是，MPTP注射7 d后，將一根長55 cm直徑0.8 cm的木桿上端纏以紗布以防止打滑，作為實驗爬桿。測試時將被測小鼠頭向上置于木桿頂端。分別記錄小鼠轉身時間(T-turn)和完全爬到桿底所需要的時間(T-LA)并作統計學分析。每只小鼠測3次取平均值。爬桿時間參數的延長反應小鼠運動功能損害的程度。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1免疫組織化學檢測 對照組小鼠中腦黑質區偶見COX-2、PGE2和caspase-3陽性細胞， 模型組COX-2、PGE2和caspase-3陽性細胞數量顯著增多；經羅格列酮處理后，COX-2、PGE2和caspase-3陽性細胞較模型組降低(P<0.05)。對照組小鼠黑質區可見大量TH陽性神經元，與對照組比較，模型組TH陽性神經元大量丟失，經羅格列酮處理后，TH陽性神經元丟失程度明顯減輕(P<0.05)。見表1。

2.2免疫印跡檢測 免疫印跡結果顯示，對照組僅有微量COX-2、PGE2和caspase-3表達，模型組COX-2、PGE2和caspase-3表達水平升高(P<0.05)；經羅格列酮處理后，COX-2、PGE2和caspase-3蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；模型組TH表達較對照組降低，羅格列酮治療后出現明顯升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組小鼠中腦黑質COX-2，PGE2，caspase-3和TH陽性細胞數

表2 各組小鼠中腦黑質COX-2，PGE2，caspase-3和TH蛋白表達水平

2.3行為學檢測 MPTP注射7 d后，模型組小鼠出現典型PD樣癥狀，表現為豎毛、翹尾、震顫和運動變緩等特征。爬桿試驗中，與對照組小鼠比較，出現爬桿能力下降，爬桿所需用時間顯著延長。羅格列酮處理后，小鼠運動功能得到一點程度改善，表現為爬桿時間明顯縮短(P<0.05)。見表3。

表3 羅格列酮對不同組小鼠爬桿時間的影響

3 討 論

PD是一種常見于中老年人中樞神經系統退變性疾病，其病理改變主要為中腦黑質區DA能神經元變性壞死，DA合成減少，進而抑制乙酰膽堿的功能降低，兩者失衡從而出現“震顫麻痹”。迄今為止，病因及發病機制不詳。

研究表明，細胞凋亡是PD發病的重要機制之一〔4〕。caspase-3是細胞凋亡過程的最終執行者，在DA能神經元變性中可能起重要作用〔5〕。COX-2是炎癥介質PGE2合成的限速酶，有研究顯示，COX-2及其介導的炎癥介質PGE2可能參與DA能神經元丟失〔6〕。本實驗采用MPTP制備PD小鼠模型，于MPTP注射后第7天觀察了小鼠黑質區COX-2、PGE2和凋亡因子caspase-3的表達及TH神經元丟失情況。免疫組化結果顯示，模型組小鼠黑質區TH陽性神經元顯著丟失，同時伴有COX-2、PGE2和caspase-3大量表達，而對照組未出現上述變化；免疫印跡檢測，結果也顯示了同樣的趨勢。這些現象表明，DA能神經元丟失可能與炎癥反應及細胞凋亡存在密切聯系。

目前，對PD的治療仍然是控制癥狀，左旋多巴是治療PD的首選藥物，但它并不能阻止病程進展，長期應用會使疾病惡化。文獻報道，羅格列酮能減少脊髓損傷后神經細胞凋亡,促進神經功能的恢復〔7〕，在亨廷頓疾病中，羅格列酮可防止線粒體功能障礙，對神經元起到保護作用〔8〕。最近研究發現，在MPTP所致PD慢性動物模型中，羅格列酮可以通過降低小膠質細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ表達水平從而抑制炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)-α產生〔9〕。由于MPTP選擇性破壞黑質DA能神經元導致黑質紋狀體神經末梢DA遞質大量減少，從而出現PD樣癥狀。

綜上，在本實驗條件下，MPTP可誘導模型動物中腦黑質COX-2、PGE2和caspase-3的高表達，最終導致DA能神經元變性丟失；羅格列酮可抑制COX-2、PGE2和caspase-3表達，使DA能神經元變性丟失現象有所減輕，從而發揮一定的神經保護作用。

4 參考文獻

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