蛋白酶體抑制劑MG132聯合順鉑誘導肺癌A549細胞凋亡的機制

韓玉杰 趙 松 楊 洋 劉東雷 吳 愷 潘麗紅 朱 礫

(鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052)

肺癌是目前世界惡性腫瘤死亡的主要原因，發病率和病死率呈上升趨勢〔1〕。化療是肺癌治療的一種重要手段〔2〕，但是目前肺癌細胞對化療藥物的耐藥性以及毒副作用仍為治療過程中一大難題。三肽基乙醛蛋白酶體抑制劑(MG132)(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)是一種常用的肽醛類26S蛋白酶體抑制劑，它能夠抑制泛素-蛋白酶體通路〔3〕介導的蛋白質降解，如影響核轉錄因子(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)和凋亡抑制蛋白等的降解過程，從而影響細胞增殖促進細胞凋亡，是一種潛在的抗腫瘤藥物〔4〕。本實驗通過聯合MG132和順鉑(DDP)作用于肺癌A549細胞，觀察A549細胞抑制率、凋亡情況以及凋亡相關蛋白NF-κB、caspase9表達情況。探討MG132和DDP聯合應用調控A549細胞凋亡的作用機制，為肺癌的生物化療提供了新的治療思路和實驗證據。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 肺癌A549細胞由河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室惠贈；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst33342熒光染料購于美國Sigma公司；DDP購于山東齊魯制藥有限公司。MG132購于Calbiochem公司。胎牛血清購于美國HyClone公司。無血清細胞凍存培養液(RPMI1640)、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購買于北京索萊寶科技有限公司公司。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。兔抗人B-actin單抗、兔抗人caspase9多抗、兔抗人NF-κB多抗購于Santa Crus公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組 肺癌A549細胞培養于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2飽和適度的培養箱。1次/d更換培養液，用胰蛋白酶液(含0.02%EDTA和0.25%胰酶)消化細胞傳代或實驗操作。實驗分組為不加藥物干預的對照組、MG132組、DDP組、MG132與DDP聯合組(同時加入MG132和DDP)。

1.2.2MTT法檢測細胞抑制率 取對數生長期的肺癌A549細胞，以1×105個/ml濃度接種于96孔板，100 μl/孔，培養24 h，棄培養液，分別加入一系列濃度的DDP及MG-132，100 μl/孔，每個濃度設置5個復孔，對照組加入等體積的培養液，藥物分別干預24、48、72 h后每孔加入5 g/L的MTT 10 μl，于37℃、5%CO2飽和適度的培養箱中孵育4 h，棄去培養液，每孔加入DMSO 100 μl，震蕩10 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞抑制率=〔1-實驗組A450/對照組A490〕×100%，每次實驗重復3次。

1.2.3Hoechst33342染色檢測細胞形態變化 用胰蛋白酶液處理對數生長期的肺癌A549細胞，制成1×105個/ml細胞懸液，接種于24孔板中，待細胞貼壁后，按實驗濃度的MG132、DDP、聯合組作用細胞24 h，棄培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加入終濃度1 mg/L的Hoechst33342避光染色，37℃孵育20 min棄染液，PBS沖洗2次，然后置于倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化并攝片，計算熒光染色陽性細胞百分比。

1.2.4流式細胞術(FCW)檢測細胞凋亡率 取對數生長期的肺癌A549細胞，胰蛋白酶消化制成1×105個/ml細胞懸液，接種于6孔板中，待細胞貼壁后，按實驗濃度的MG132、DDP、聯合組作用細胞24 h，收集懸浮及貼壁細胞，冷PBS洗滌細胞2次，加入400 μl Annexin結合液懸浮細胞，使細胞濃度約為1×106個/ml，細胞懸浮液中加入5 μl Annexin-FITC，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI，4℃避光孵育5 min；流式細胞儀檢測，每次實驗重復3次。

1.2.5Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達 取對數生長期的肺癌A549細胞，每孔2×105個/ml接種于6孔板，細胞貼壁后按實驗濃度的MG132、DDP、聯合組加入，培養24 h后收集懸浮及貼壁細胞，提取細胞蛋白，將等量的蛋白以12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，再加入一抗caspase9、NF-κB及B-actin(抗體稀釋濃度為1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌3次，于硝酸纖維素膜上滴加化學發光法(ECL)顯影，結果用圖像處理儀(Gene Company)掃描，Image J軟件分析條帶的灰度值。

2 結 果

2.1MTT法檢測藥物最適濃度和作用時間 隨著MG132和DDP的濃度和作用時間增加，細胞生長抑制率增加，呈濃度及時間依賴性。當MG132作用24 h時，IC50約為30 μmol/L；當DDP作用24 h時，IC50約為20 mg/L，因此本實驗中MG132和DDP最適濃度分別為5 μmol/L和2.5 mg/L。

2.2Hoechst33342染色檢測細胞形態變化 Hoechst33342能少許進入正常細胞膜，使其染上低藍色，而凋亡細胞的膜通透性增強，染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合因此進入凋亡細胞中的Hoechst33342比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高，并且凋亡細胞的染色體DNA結構也發生了改變。MG132組和DDP組，細胞核裂解，染色質凝集，表明細胞發生凋亡，Hoechst33342染色陽性細胞百分比分別為(15.2±0.1)%、(12.1±0.3)%。MG132與DDP聯合組陽性細胞百分比為(33.5±1.3)%，與單用藥組相比細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。見圖1。

2.3Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達 對照組、MG132組、DDP組及MG132+DDP組caspase9和NF-κB蛋白相對灰度值分別為0.37±0.12、0.46±0.04、0.49±0.07、0.72±0.14和0.75±0.08、0.53±0.02、0.59±0.07、0.34±0.01，差異均有統計學意義(均P<0.05)。MG132與DDP聯合組干預24 h后caspase9表達明顯增高，與單用藥組相比具有統計學意義(P<0.05)；兩藥聯合干預24 h后，與單用藥組相比，NF-κB表達明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 Hoechst33342染色檢測細胞形態變化(×200)

圖2 Western印跡檢測Bax和NF-κB蛋白的表達情況

2.4FCW檢測細胞凋亡率 流式細胞儀檢測MG132組細胞凋亡率為(22.13±0.36)%，與對照組(3.1±0.3)% 相比具有統計學意義(P<0.05)。DDP組細胞凋亡率為(25.76±0.25)%，與對照組相比具有統計學意義(P<0.05)。MG132與DDP聯合組細胞凋亡明顯增加，為(68.27±0.31)%，與MG132組相比具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 MG132和DDP作用24 h后細胞凋亡情況

3 討 論

肺癌發病率居惡性腫瘤首位，其中約80%為非小細胞肺癌。但是由于多數非小細胞肺癌患者就診時已喪失手術機會，因此化療就成為主要的治療方法之一〔5〕。鉑類藥物(DDP、卡鉑)是肺癌一線化療方案的基礎，DDP的主要作用靶點是DNA，進入腫瘤細胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細胞DNA形成DDP-DNA加合物，干擾細胞DNA的復制與轉錄，從而導致DNA錯配并誘發細胞凋亡〔6〕。然而單用DDP易引起腫瘤的多種耐藥性，且其毒副作用較大，腫瘤的耐藥性一直是臨床化療難以克服的障礙〔7〕。因此，尋找新的毒副作用小耐藥性小抗腫瘤作用靶點已成為當今的研究熱點。

泛素蛋白酶體通路(UPP)是真核細胞中內源性蛋白質選擇性降解的重要途徑，阻斷UPP可以提高凋亡信號的活性從而促使一些腫瘤細胞發生凋亡〔8〕。蛋白酶體抑制劑可以通過阻斷蛋白酶體途徑進而誘導多種腫瘤細胞凋亡，是一種非常有發展前途的抗腫瘤作用靶點〔9〕。目前，蛋白酶體抑制劑硼替佐米已被美國FDA認證是治療多發性骨髓瘤的有效藥物，其作用機制主要通過NF-κB信號通路抑制腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡〔10〕。MG132是一種常見的醛基肽類特異性蛋白酶體抑制劑，已有許多研究證明它可以誘導多發性骨髓瘤、前列腺癌、卵巢癌、惡性血液病等多種腫瘤細胞的凋亡〔9〕。MG132通過抑制蛋白酶體的活性，進而抑制NF-κB的降解，阻止NF-κB釋放，抑制NF-κB啟動的基因轉錄，導致細胞凋亡蛋白水平降低，使細胞色素C容易與Apaf-1結合形成“凋亡小體”，激活caspase-9從而誘導細胞凋亡〔11〕。NF-κB是一種抑制細胞凋亡因子，調控多種免疫、炎癥反應，在腫瘤的增殖、分化、轉移和放化療抵抗方面也起到重要的作用〔12〕。本研究提示，MG132與DDP聯合作用促凋亡作用明顯提高，其部分作用機制可能是蛋白酶體抑制劑MG132抑制DDP誘導腫瘤細胞中NF-κB的釋放，提高了腫瘤細胞對DDP誘導凋亡的敏感性，進一步增強下游凋亡相關蛋白caspase9的活化以及表達。

綜上，MG132與DDP聯合應用能明顯提高肺癌A549細胞凋亡率，并探討其部分作用機制。這一研究成果，為臨床上蛋白酶體抑制劑與化療藥物聯合應用提高腫瘤對化療藥物的敏感性提供了實驗依據。相信隨著人們今后對蛋白酶體抑制劑的進一步研究，其在腫瘤的治療過程中的作用機制也將得到明確。雖然本研究的體外實驗結果有效，但是是否能有效地應用于臨床治療中，還需進一步進行動物實驗來加以考證。

4 參考文獻

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