瘦素對(duì)大鼠氣道平滑肌β2腎上腺素能受體表達(dá)的影響

陳云峰 朱述陽 劉向群 劉文靜 吳 瑕 倪文靜

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221002)

研究證實(shí)肥胖是支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)的危險(xiǎn)因素，并且可使哮喘發(fā)展為難治性哮喘〔1〕，而瘦素(LP)是脂肪組織表達(dá)的促炎分子的中心成員，在哮喘發(fā)病中具有重要的作用，能夠促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的釋放，并可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖〔2〕，其在血清濃度升高可導(dǎo)致肺功能下降。β2腎上腺素能受體(β2-AR)在肺內(nèi)分布廣泛，哮喘的發(fā)作與β2-AR失常有密切聯(lián)系〔3〕。β2-AR與肺功能密切相關(guān)，在哮喘急性發(fā)作時(shí)β2-AR數(shù)量減少，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷(cAMP)下降，這是支氣管痙攣的重要原因。多種炎癥介質(zhì)可以抑制β2-AR的表達(dá)，如白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等。有研究顯示，肥胖時(shí)β2-AR表達(dá)降低并且存在基因多態(tài)性變化，但其作用機(jī)制尚不明確，考慮可能與LP有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞水平研究LP對(duì)大鼠氣道平滑肌β2-AR表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解LP在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 150～200 g SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；LP(Alexis公司)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司 )；兔抗大鼠β2-AR(武漢博士德公司)；胎牛血清(杭州四季青有限公司 )；胰蛋白酶(Sigma 公司)；PBS(北京中杉公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒；RT-PCR一步法檢測(cè)試劑盒(北京天根公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司)；瘦素拮抗劑(ProSpec-Tany公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)的培養(yǎng) 將大鼠用水合氯醛麻醉后，在無菌條件下縱行剖開氣管，小心剝離外膜，并輕輕刮除內(nèi)膜，用眼科剪將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，將組織塊移入培養(yǎng)瓶瓶底，等距排列，倒置培養(yǎng)瓶，加入含25%胎牛血清的培養(yǎng)液3 ml，將貼有組織塊的一側(cè)朝上，使其不與培養(yǎng)液接觸，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，3 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，半開放式靜置培養(yǎng)3 d后將培養(yǎng)液添至5 ml，繼續(xù)置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，第6天全換液，此后每3 d換液1次。ASMCs通過傳代自然純化，實(shí)驗(yàn)用第4～6代細(xì)胞。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)，LP 50、100、200 ng/L組(B、C、D組)及LP拮抗劑組(LP 200 ng/L+LP拮抗劑200 ng/L，E組)。

1.2.2細(xì)胞鑒定 ①細(xì)胞形態(tài)學(xué):應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察，觀察細(xì)胞的大小、形態(tài)及排列方式等。②免疫熒光染色法:將消毒好的大小合適的玻片放入六孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)，把收集好的細(xì)胞加入孔內(nèi)，加入2 ml高糖培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合約50%～60%時(shí)取出玻片,加入37 ml/L甲醛液在室溫下固定30 min，用100 ml/L山羊血清(PBS配制)封閉非特異性抗原30 min，抗SMC-α-actin(1∶200 PBS稀釋)室溫下孵育細(xì)胞2 h，用熒光標(biāo)記二抗(1∶200 PBS稀釋)在4℃孵育細(xì)胞過液，然后用熒光封片劑封片后在熒光顯微鏡下檢測(cè)。

1.2.3Western印跡法測(cè)定瘦素受體(Ob-R)及β2-AR的蛋白表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)24 h后提取細(xì)胞蛋白。依次經(jīng)配膠、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)及封閉后，分別加入兔抗大鼠β2-AR抗體過夜，洗膜后，加入二抗(小鼠抗兔IgG)孵育2 h，以NBT/BCIP顯色后用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光半定量PCR測(cè)定Ob-R及β2-AR的表達(dá) 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR 法測(cè)定：分組同上，干預(yù)24 h后收集ASMCs，TRNzol法提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度。擴(kuò)增β2-AR基因引物序列：上游：5′-GAGACCCTGTGCGTGATTGC-3′；下游；5′-CCTGCTCCACCTGGCTGAGG-3′擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度265 bp；擴(kuò)增內(nèi)參照β-actin基因引物序列:上游：5′-ACTCAGGAACGGGACGAA-3′；下游：5′-TGATTGCAGTGGATCGCTA-3′擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度257 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，72℃ 60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增Ob-R基因引物序列：上游：5’-CAGATTCGATATGGCTTAAATGG-3’，下游：5’-GTTAAAATTCACAAGGGAGGCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 474 bp。擴(kuò)增內(nèi)參照β-actin基因引物序列:上游：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，下游：5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為473 bp。Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。采用相對(duì)定量方式表示各組β2-AR mRNA表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果以每個(gè)樣本目的基因CT平均值減去內(nèi)參CT平均值，對(duì)應(yīng)為每個(gè)樣本的CT值(△Ct)。

2 結(jié) 果

2.1ASMCs鑒定 在倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的ASMCs呈梭形，平行生長(zhǎng)，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯(cuò)呈“峰谷”狀。免疫熒光染色法表明，抗平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體呈陽性染色者，胞質(zhì)內(nèi)可見大量綠色熒光，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為ASMCs(圖1)。

2.2Western印跡法檢測(cè)β2-AR及Ob-R蛋白的表達(dá) 與A組相比，Ob-R蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05)；予LP拮抗劑后，Ob-R表達(dá)較LP干預(yù)組降低(P<0.05)，較A組無顯著差異(P<0.05)。與A組相比，β2-AR蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05)；予LP拮抗劑后，β2-AR表達(dá)較LP干預(yù)組升高(P<0.05)，較A組無顯著差異(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖1 ASMCs的鑒定(×100)

1～5:A、B、C、D、E組

1～5：A、B、C、D、E組

2.3實(shí)時(shí)熒光半定量RT-PCR測(cè)Ob-R及β2-AR mRNA的表達(dá) 與A組相比,B、C、D組Ob-R表達(dá)明顯升高，而β2-AR表達(dá)下降，證實(shí)LP可以上調(diào)Ob-R的表達(dá)并抑制β2-AR的表達(dá)；E組Ob-R表達(dá)較B、C、D組下降(P<0.05)，與A組相比(P>0.05)；E組β2-AR表達(dá)較B、C、D組升高(P<0.05)，與A組相比(P>0.05)。見表1。

表1 Ob-R及β2-AR的相對(duì)表達(dá)量值)

3 討 論

1980～2008年，兒童中哮喘的發(fā)病率從3.5%上升至9.4%，在成人中由2.9%升高至7.3%〔2〕。與此同時(shí)，在美國(guó)20歲以上的成年人中，接近65%為超重或者肥胖的，這一數(shù)據(jù)與10年前相比升高了10%〔4〕。肥胖是哮喘的危險(xiǎn)因素之一〔5，6〕，并且加重了哮喘的嚴(yán)重程度〔7〕。肥胖對(duì)哮喘的影響有很多方面，炎癥因素是肥胖促進(jìn)哮喘的主要機(jī)制。吸入糖皮質(zhì)激素、β2腎上腺素能受體激動(dòng)劑和膽堿能受體拮抗劑是目前用來治療哮喘的最基本藥物，主要通過抑制氣道炎癥和擴(kuò)張支氣管而改善哮喘癥狀。與正常體重患者相比，肥胖的哮喘患者需要應(yīng)用更大劑量的β2-AG及激素〔8〕。有研究顯示，減肥可以減輕哮喘的嚴(yán)重程度及癥狀〔9，10〕。

LP是脂肪組織表達(dá)的促炎分子的中心成員，肥胖患者的血清LP水平比正常人高4～6倍〔11〕。LP主要通過作用于Ob-R而發(fā)揮作用，在氣道平滑肌細(xì)胞中存在Ob-R的表達(dá)。徐成勝等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)LP可在體外上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞Ob-R的表達(dá)，但在氣道平滑肌細(xì)胞中研究甚少，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，LP干預(yù)后可于體外上調(diào)氣道平滑肌細(xì)胞Ob-R表達(dá)。LP在哮喘的發(fā)病過程中起重要的作用，它可以刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-6，TNF-α，白三烯等〔13，14〕，并且可以促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖。同時(shí)平滑肌細(xì)胞表形的改變可能是決定重度哮喘對(duì)激素敏感性較差的原因之一〔15〕。研究證實(shí)，血清LP濃度與肺功能密切相關(guān)，降低血清LP水平可使肺功能升高。

β2-AR是一種G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)，GPCRs關(guān)聯(lián)著體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡、損傷后修復(fù)等諸多過程，β2-AR廣泛分布于支氣管平滑肌和肺組織內(nèi)，β2-AR的數(shù)量與肺功能呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)哮喘發(fā)作時(shí)，受反復(fù)使用β2-AG及多種炎癥介質(zhì)，如白三烯、前列腺素等作用的影響，使β2-AR含量明顯降低〔16〕，導(dǎo)致氣道平滑肌痙攣，過敏介質(zhì)釋放增加，黏膜水腫和黏液分泌增加等病理變化。在外周白細(xì)胞β2-AR的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1，TNF-γ及GM-CSF均可影響其功能。有研究〔17〕證實(shí)豚鼠肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基數(shù)量級(jí)氣道β2-AR功能損害程度之間存在密切相關(guān)，用大鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)也顯示了氧自由基可致β2-AR密度降低。β2-AG是目前臨床應(yīng)用最廣的支氣管解痙劑，已廣泛應(yīng)用于支氣管哮喘的急性發(fā)作的治療，可以有效地緩解哮喘的急性癥狀，并且可以抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖。β2-AG治療支氣管哮喘的藥理機(jī)制是通過選擇性刺激氣道內(nèi)的β2-AR，從而松弛氣道平滑肌，達(dá)到支氣管擴(kuò)張效應(yīng)〔18〕。在肥胖的哮喘患者中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)β2-AG的反應(yīng)性降低，與研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果提示LP可以呈濃度依賴性抑制氣道平滑肌細(xì)胞β2-AR的表達(dá)。可能的機(jī)制有：①LP可能通過上調(diào)PKA，使其介導(dǎo)的受體磷酸化后被吞，并被傳輸?shù)饺苊阁w后被降解，也有可能是通過cAMP途徑使β2-AR表達(dá)降低。②LP可能通過PI3K通路，作用于Rho蛋白家族調(diào)節(jié)β2-AR的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)細(xì)胞觀察到了這一現(xiàn)象，與動(dòng)物模型及人類有一定的差別，所以下一步可以通過動(dòng)物模型及人體實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討了LP在支氣管哮喘發(fā)病中的作用，為哮喘的預(yù)防提供了一個(gè)新的思路。

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