膿毒癥大鼠脂聯素的表達變化及與TNF-α的關系

陳建南 丁毅鵬

(海南省人民醫院急診科，海南 海口 570311)

膿毒癥及其引起的多種器官功能障礙是感染、創傷、嚴重燒傷等危重患者死亡的主要原因之一〔1, 2〕。研究發現，一些創傷較嚴重的疾病并發膿毒癥的概率在逐年遞增，嚴重危害人類的生命。醫療界一直在尋找治療膿毒血癥的有效方法。脂聯素(ADP)是一種具有內源活性的多肽，主要是由脂肪細胞分泌的。研究發現，很多慢性疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病等患者體內的ADP水平較低，而炎癥因子的表達較高〔3,4〕。這兩者的變化是否與膿毒癥有關，目前研究較少。本研究采用大鼠膿毒血癥的模型，觀察大鼠的生存率以及組織中ADP以及炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平，初步探討膿毒血癥的發生發展與ADP以及TNF-α表達水平之間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物模型 取健康的雄性Wistar大鼠60只，體重200～300 g，隨機分成正常對照組、膿毒血癥組、生存率觀察對照組、生存率觀察膿毒血癥組，每組15只。兩組大鼠均采用七氟醚吸入麻醉后，尾靜脈注射內毒素(LPS)或者生理鹽水。在注射后4、24 h分別處死大鼠，檢測血漿中ADP以及TNF-α的水平，組織中檢測ADP以及TNF-α mRNA的水平變化。另兩組生存率觀察組大鼠采用相同的飼養條件以及相同的處理方法，觀察其24 h的生存率。

1.2標本采集 大鼠采用七氟醚吸入麻醉后，抽取全血5 ml，1 200 r/min離心10 min，收集血漿，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，并且留取大鼠附睪脂肪組織，-80℃保存。

1.3RT-PCR檢測組織中ADP以及TNF-α mRNA的水平 取脂肪組織80 mg，超聲勻漿后按照說明書用Trizol法提取RNA，LPS的上游序列為5′-TCCTGGTCACAATGGGATACC-3′，下游序列為5′-ATCTCCTGGGTCACCCTTAGG-3′， TNF-α的上游序列為5′-GTAGCCCACGTCGTAGCAAA-3′， 下游序列為5′-TGGTGAAAGACGCCAGTAGACTC-3′。PCR反應條件為94℃ 5 min，94℃ 40 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s，共32個循環，最后72℃ 10 min。

1.4ELISA法檢測血漿中ADP以及TNF-α的水平 按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

2 結 果

2.1兩組大鼠生存率及一般情況比較 正常組大鼠表現正常，而膿毒血癥組大鼠在造模后30 min開始出現豎毛、厭食、眼角分泌物增多等中毒癥狀，并且隨著時間的推移出現腹瀉、精神萎靡、血尿等休克癥狀，嚴重者死亡；在24 h內，正常對照組大鼠未發生死亡，膿毒血癥組大鼠死亡9只，死亡率為60%，說明大鼠膿毒血癥造模成功。見圖1。

2.2兩組大鼠血漿中ADP以及TNF-α的水平 膿毒血癥組大鼠血漿中ADP在注射4 h后開始下降，并持續下降至24 h時。而TNF-α的水平在注射4 h后顯著升高，在24 h時顯著下降，但與正常對照組相比差異仍具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 兩組大鼠生存曲線

表1 兩組大鼠血漿中ADP以及TNF-α的水平

2.3兩組大鼠組織中ADP以及TNF-α mRNA的水平 用RT-PCR的方法檢測兩組大鼠組織ADP以及TNF-α mRNA的水平發現，膿毒血癥大鼠在注射LPS 4 h后，ADP的表達較正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)，而TNF-α mRNA的表達顯著增高(P<0.05)；在注射LPS 24 h后，ADP的表達較正常對照組顯著下降，而TNF-α mRNA的表達仍顯著增高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠組織中ADP以及TNF-α mRNA的水平

2.4ADP以及TNF-α mRNA的水平與血漿中相應指標水平的相關性分析 通過對兩者進行Spearman相關性分析，發現膿毒血癥組大鼠組織中ADP mRNA水平與血漿中ADP的水平呈正相關(r=0.912，P=0.000)，TNF-α的相關性分析也呈相同的趨勢(r=0.823，P=0.000)。

3 討 論

目前對膿毒癥的研究主要集中實驗動物上，通常用對大鼠尾靜脈注射LPS造模形成大鼠膿毒血癥以供研究〔5,6〕。

ADP是一種由多種基因決定的內源性生物活性多肽。在多種研究中發現，一些患糖尿病、動脈粥樣硬化、肥胖、冠心病的患者會表現出低ADP血癥，提示ADP與代謝性疾病有一定的關系〔7，8〕。本研究說明ADP的水平在膿毒癥這種急性炎癥中出現下降，提示機體內ADP水平的高低可能影響了膿毒癥的發生發展。

TNF-α是一種機體內常見的致炎因子，ADP在體內可以抑制TNF-α等致炎因子的表達，以減輕甚至終止炎性反應，在機體的免疫反應中也起著很重要的負性調節作用〔9,10〕。有研究表明，用藥物提高膿毒血癥大鼠血液中的ADP濃度可以提高大鼠的生存率，可能與其抑制炎癥因子的表達有關。本研究說明在膿毒癥大鼠的體內，ADP與TNF-α的變化方向相反，提示在體內兩種因子的表達相互拮抗，ADP有潛在的抗炎作用。

綜上，在膿毒癥大鼠體內，ADP與TNF-α表達相互拮抗，可能在膿毒癥的發生發展過程中起著重要的調節作用，在以后的治療過程中，可能通過提高血漿和組織中ADP的濃度或者增加ADP受體的敏感度來改善膿毒癥的治療效果。

4 參考文獻

1Xu L, Bao HG, Si YN,etal.Effects of adiponectin on acute lung injury in cecal ligation and puncture-induced sepsis rats〔J〕.J Surg Res，2013；183(2):752-9.

2Uji Y, Yamamoto H, Maeda K,etal.Adiponectin deficiency promotes the production of inflammatory mediators while severely exacerbating hepatic injury in mice with polymicrobial sepsis〔J〕.J Surg Res，2010；161(2):301-11.

3Vachharajani V, Cunningham C, Yoza B,etal.Adiponectin-deficiency exaggerates sepsis-induced microvascular dysfunction in the mouse brain〔J〕.Obesity (Silver Spring)，2012；20(3):498-504.

4吳艷春,黃立權,王靈聰,等.膿毒癥患者血清脂聯素水平的初步研究〔J〕.中華危重癥醫學雜志(電子版),2010；3(5):297-300.

5Robinson K, Prins J, Venkatesh B.Clinical review: adiponectin biology and its role in inflammation and critical illness〔J〕.Crit Care，2011；15(2):221.

6Robinson K, Kruger P, Prins J,etal.The metabolic syndrome in critically ill patients〔J〕.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011；25(5):835-45.

7Gil A, Olza J, Gil-Campos M，etal.Is adipose tissue metabolically different at different sites〔J〕? Int J Pediatr Obes，2011；6(1)：13-20.

8李 莎,鮑紅光.膿毒癥大鼠脂聯素表達水平變化的實驗研究〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版),2011；5(1):125-9.

9湯石林,符 暉,趙正亮,等.膿毒癥患者血清脂聯素水平及與炎癥因子的相關性研究〔J〕.中國現代醫學雜志,2011；21(15):1853-5，1858.

10Pini M, Castellanos KJ, Rhodes DH,etal.Obesity and IL-6 interact in modulating the response to endotoxemia in mice〔J〕.Cytokine，2013；61(1):71-7.