肝細胞生長因子在糖尿病大鼠肝臟的表達

王靜波

(解放軍第309醫院眼科，北京 100091)

肝細胞生長因子(HGF)是目前已知的生物活性最廣泛的生長因子之一。HGF通過與特異性膜受體c-met結合而發揮其多樣生物學作用。除了促進有絲分裂活性外，HGF還作為離散因子促進細胞擴散和遷移。研究證實，HGF/c-met在組織器官損傷后的再生中發揮重要作用。本研究觀察糖尿病大鼠肝臟中HGF的表達變化。

1 材料與方法

1.1試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)，兔抗鼠HGF多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，枸櫞酸鹽粉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑、二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒、蘇木素(北京中杉金橋生物技術有限公司，北京)，安穩血糖儀及血糖測試條(長沙三諾有限公司)，冷凍包埋劑(櫻花，美國)。

1.2實驗動物及模型制備 雄性SD大鼠24只，SPF級，體質量(120±20 g)，由軍事醫學科學院動物中心提供。大鼠在SPF級動物中心飼養，室內溫度25℃左右，濕度約50%。明暗周期12 h，自由飲水和進食。適應性喂養1 w后，進行動物造模。

造模前，禁食12 h(不禁水)。STZ 65 mg/kg腹腔注射，對照組腹腔注射枸櫞酸鹽溶液。72 h后測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。每周監測血糖。

1.3標本制備 造模成功后第3、6、9、12和15周，分別采用過量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝臟。切取塊狀肝臟大葉組織，冷凍包埋劑包埋，連續切出5 μm厚度切片，貼于免疫組化專用防脫載玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4免疫組化染色及結果判讀 冰凍切片用PBS沖洗，3%過氧化氫溶液室溫10 min，PBS洗，稀釋的HGF抗體(1∶200)室溫孵育2 h，通用型IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體37℃ 20 min，PBS洗，DAB顯色，PBS洗，蘇木素復染，自然水沖洗，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹膠封片，照相。所有切片由同一位經驗豐富的病理科醫師盲法閱片做出判定，每張切片觀察5個×400視野。以組織切片背景清晰、細胞漿染為淡黃至棕黃色為陽性細胞標志。結果判定標準如下：不著色者為陰性，淡黃色及著色細胞<1/3為弱陽性，黃色及著色細胞占1/3～1/2為中度陽性，棕褐色著色陽性細胞>1/2為強陽性。

2 結 果

2.1糖尿病大鼠一般情況觀察 對照組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動作自如，反應靈敏。糖尿病大鼠出現了典型的“三多一少”癥狀，多飲、多食、多尿，明顯消瘦，精神逐漸萎靡，早期多動，后期反應遲鈍，動作緩慢，毛豎而無光澤。12 w時，部分大鼠出現白內障。

2.2肝臟一般結構觀察 對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊。糖尿病組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞的胞質內可見大量小空泡。糖尿病12 w時，肝細胞開始水腫；糖尿病15 w時，肝細胞水腫尤明顯。

2.3肝細胞HGF的表達 對照組大鼠肝細胞HGF呈弱陽性表達。糖尿病3 w時，肝細胞HGF表達即開始增強。糖尿病6 w時，肝細胞HGF呈中度陽性表達。糖尿病12 w時，肝細胞HGF呈強陽性表達。糖尿病15 w時，肝細胞HGF的表達較12 w時減弱，但較對照組仍明顯增強。見圖1。

圖1 大鼠肝臟肝細胞生長因子的表達 (免疫組化，×200)

3 討 論

在美國，肝臟病變是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一。2型糖尿病患者肝臟病變的標準死亡率遠遠高于心血管并發癥的標準死亡率。糖尿病肝臟病變包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝細胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常見的是非酒精性脂肪肝病。非酒精性脂肪肝病在2型糖尿病患者中發病率達50%，在糖尿病伴肥胖患者中發病率近100%〔1，2〕。

HGF是一種分泌型肝素親和糖蛋白，由間質細胞產生，與受體c-met結合并激活該受體的酪氨酸酶活性，促進肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、造血細胞等多種細胞的生長、遷移、形態變化〔3〕。HGF對肝細胞有直接保護作用，可改善肝纖維化、降低死亡率〔4〕。在高表達HGF的轉基因小鼠，半乳糖胺對肝細胞的損傷幾乎被完全抑制。在肝臟部分切除后，肝細胞HGF的表達增強，促進了肝細胞的增殖，促進損傷的修復〔5〕。因而，HGF是肝細胞的保護劑。除了保護肝細胞外，HGF可保護機體的很多細胞，如腎小球細胞、腎小管細胞、血管內皮細胞、胰島細胞〔6，7〕。高糖刺激的血管內皮細胞、腎小管上皮細胞及腎小球細胞，HGF的表達均表現為先增高后減低的趨勢〔6〕。與對照組相比，胰島過度表達HGF的轉基因小鼠，胰島體積增大，胰島數量增多，β細胞復制率提高〔7，8〕。HGF干預能使糖尿病大鼠β細胞凋亡指數顯著降低〔8〕。

在糖尿病早期，高糖損傷引起機體防御反應，肝細胞HGF表達增加，促進細胞有絲分裂，對損傷的細胞進行修復；隨著高糖刺激時間的延長，機體防御反應的能力逐漸下降，高糖誘導了細胞的凋亡，HGF表達下調。Araújo等〔9〕的研究表明，HGF/c-met可能在肝臟胰島素信號轉導中起重要作用。

在本研究中，筆者觀察到糖尿病肝臟中HGF蛋白呈先增高后減低的趨勢改變。但HGF的這種變化對肝細胞的作用及其作用機制尚需更進一步的研究。

4 參考文獻

1Tolman KG，Fonseca V，Tan MH,etal.Narrative review：hepatobiliary disease in type 2 diabetes mellitus〔J〕.Ann Intern Med，2004；141:946-56.

2王蓉蓉，謝 琳，吳曉燁，等.銀杏葉提取物對實驗性2型糖尿病大鼠肝臟的保護作用〔J〕.中國病理生理雜志，2007；23(4):566-9.

3Nakamura T，Matsumoto K，Mizuno S,etal.Hepatocyte growth factor prevents tissue fibrosis，remodeling，and dysfunction in cardiomyopathic hamster hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005；288:2131-9.

4任春峰，陳會松，王青霞.促肝細胞生長因子對ConA致小鼠肝損傷保護機制探討〔J〕.中國實驗診斷學，2008；12(12):1483-5.

5朱 洪，肖曙峰，田大廣，等.HGF和SAM對慢性肝損傷大鼠肝部分切除術后肝細胞的影響〔J〕.中國普通外科雜志，2009；18(1):40-3.

6劉青娟，何 寧，劉淑霞，等.糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細胞轉化與肝細胞生長因子的表達〔J〕.中國慢性病預防與控制，2005；13(6):266-8.

7陳洪流，蒙碧輝，黃 松，等.羅格列酮對糖尿病大鼠殘存胰島表達肝細胞生長因子的影響〔J〕.中國糖尿病雜志，2010；18(1):63-6.

8Dai C，Huh CG，Thorgeirsson SS,etal.Beta-cell-specific ablation of the hepatocyte growth factor receptor results in reduced islet size，impaired insulin secretion，and glucose intolerance〔J〕.Am J Pathol，2005；167:429-36.

9Araújo TG，Oliveira AG，Carvalho BM,etal.Hepatocyte growth factor plays a key role in insulin resistance-associated compensatory mechanisms〔J〕.Endocrinology，2012；153:5760-9.