黃芪多糖對人肝癌細胞HepG2凋亡相關基因表達的影響

陳瑾歆 何 軍 張娟娟 蒲 宇 王含彥

(川北醫學院生物化學教研室,四川 南充 637000)

肝癌發病隱匿，早期無明顯癥狀，發展迅速，預后差，目前尚無的特效治療方法，常規化療效果不佳，且西醫化療不良反應大，特別是老年患者難以承受，因此，副作用較小的黃芪多糖(APS)、斑蝥酸鈉(SCA)等輔助化療中藥廣泛應用于臨床，并呈現較好的臨床效果。中藥抗腫瘤作用的分子機制研究目前較少，本研究通過觀察APS聯合SCA對HepG2細胞增殖的抑制作用及細胞凋亡相關基因Bcl-2表達的影響，探討APS誘導HepG2細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肝細胞癌細胞株HepG2(HepG2)，從中國科學院上海細胞所引進；斑蝥酸鈉維生素B6注射液(貴州柏強制藥有限公司)；APS注射液(天津賽諾制藥有限公司)；RPMI1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；一抗：Bcl-2、抗GAPDH抗體(proteintech,USA)；HRP標記羊抗兔二抗(Abcam,USA)。

1.2細胞培養和分組 HepG2細胞以10%胎牛血清的RPMI1640培養基置于37℃、5%的CO2孵育箱中常規培養。實驗分為正常對照組(n=5)、SCA處理組(2.5 mg/L，n=5)、APS處理組(200 mg/L，n=5)、APS聯合SCA處理組(APS200 mg/L+SCA2.5 mg/L，n=5)。以RPMI1640培養液配制SCA和/或APS注射液。取指數生長期細胞進行實驗，血清饑餓法使細胞同步化后棄培養基，分別加入含有SCA和/或APS培養液2 ml，培養24 h備用。

1.3免疫細胞化學染色 用4%多聚甲醛固定各組HepG2細胞，采用細胞免疫組織化學SP法進行免疫組化染色，DAB顯色。以胞質呈棕黃色為陽性細胞。

1.4Western印跡 細胞處理24 h后分組收集細胞，用預冷的PBS洗3遍，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，離心10 min取上清收集細胞總蛋白，經BCA法分析定量調整蛋白濃度一致，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min。變性的蛋白樣品經12%SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗：Bcl-2(1∶800)、抗GAPDH抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(1∶7 000)室溫孵育2 h，再行TBST洗膜，加入ECL發光，常規顯影并分析圖像，每個樣本重復3次。Bcl-2的表達水平以圖像Bcl-2與GAPDH的灰度比(Bcl-2/GAPDH)表示，比值越大，Bcl-2的表達水平越高。

2 結 果

2.1APS/SCA對HepG2細胞增殖的影響 見圖1，與對照組相比較，各實驗組在單位視野中的凋亡細胞均明顯增多，其中APS聯合SCA處理組的凋亡細胞最多，提示SCA和APS對體外培養的HepG2細胞生長均有抑制作用，APS聯合SCA作用最明顯。

圖1 APS/SCA對HepG2細胞生長的抑制作用(×400)

2.2不同濃度的APS/SCA對HepG2細胞中Bcl-2表達的影響 與對照組相比(0.157±0.011)，SCA處理組和APS處理組Bcl-2表達均受到顯著抑制(0.114±0.013、0.122±0.008，P<0.01)；與APS組比較，SCA對HepG2細胞中Bcl-2表達的抑制作用較強，但二者無明顯差異(P>0.05)；APS聯合SCA處理組Bcl-2表達受到明顯抑制(0.079±0.008)，與對照組、SCA處理組、APS處理組比較均有顯著差異(P<0.01)。實驗結果提示APS聯合SCA對HepG2細胞Bcl-2表達的抑制作用更為明顯。

3 討 論

細胞凋亡是在生理或病理條件下由細胞內基因及細胞外因子調控的細胞主動死亡生物學過程〔1〕。目前認為惡性腫瘤發病的主要分子機制是細胞周期紊亂導致腫瘤細胞無限制增生和凋亡減少〔2〕，因此抑制腫瘤細胞惡性增生、誘導腫瘤細胞凋亡目前成為研究腫瘤治療新途徑的熱點。細胞凋亡機制復雜，普遍認為線粒體在細胞凋亡過程中發揮著關鍵性的作用，處于凋亡調控的中心位置，各種凋亡信號刺激細胞損傷引發線粒體內凋亡分子Caspases的級聯反應最終導致細胞產生凋亡〔3〕。Caspases凋亡分子的釋放受凋亡相關基因的調控，細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2家族)是研究最早的與凋亡有關的基因，調節上游凋亡信號進入線粒體引發細胞凋亡的線粒體途徑〔4〕。Bcl-2家族中Bcl-2為抗凋亡蛋白，其表達減少會導致細胞主動進入凋亡程序〔5〕。

黃芪在抗腫瘤方面展示了較好的效果，APS是黃芪抗腫瘤的有效成分，可調理免疫功能、減輕放化療毒副反應〔6〕。其抗腫瘤機制尚不明確，傳統研究認為APS的抗腫瘤作用可能與增強機體免疫功能的作用有關〔6〕。近年的研究發現其抗腫瘤作用可能還有其他機制如對腫瘤細胞的直接殺傷作用，有一定促進腫瘤細胞凋亡的作用等〔7〕，且APS和其他化療藥物聯合應用時具有協同抗腫瘤作用，可明顯提高腫瘤治療的療效。SCA是一種廣譜抗癌藥，對消化道惡性腫瘤有較好療效，有抗癌和免疫調節的雙重作用，目前認為作用機制可能是抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡〔8〕。本研究結果提示：APS和SCA處理HepG2細胞，均可引起細胞凋亡，APS聯合SCA處理的細胞凋亡最明顯，Western印跡法檢測各組凋亡相關基因Bcl-2的表達，APS、SCA處理組Bcl-2基因的表達均明顯抑制，但二者間無明顯差異，APS聯合SCA處理組Bcl-2表達受到的抑制作用最強，實驗結果提示APS可能通過對凋亡相關基因Bcl-2表達的調節誘導促進細胞凋亡，與SCA聯合應用會增強對腫瘤細胞的抑制作用。綜上，APS可明顯抑制凋亡相關基因Bcl-2的表達，聯合SCA對Bcl-2抑制作用更為明顯，其與BAX家族成員協同作用的分子機制還有待于進一步研究。

4 參考文獻

1Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease〔J〕.Science,1995；267:1456-62.

2Roth W.Apoptosis resistance in malignant tumors：novel apoptosis-based therapeutic〔J〕.Pathology，2009；30(2):113-6.

3趙 婧,屈 藝,母得志.Akt與細胞線粒體凋亡途徑〔J〕.生命的化學，2010；30(4):528-32.

4李捷萌，陳彥青.線粒體凋亡途徑與Bcl-2 家族蛋白研究進展〔J〕.醫學綜述，2008；14(4)：489-90.

5馮 莉,蘇奉發，李 麗,等.H2O2致Hep-G2細胞凋亡及其分子機制初探〔J〕.川北醫學院學報，2005；20(1):6-10.

6呂淑華.黃芪多糖抗腫瘤作用研究進展〔J〕.江西中醫學院學報，2009；21(1):85-7.

7孫 聰，韓業超,洪 敏，等.黃芪多糖抑制大鼠神經膠質瘤細胞增殖的實驗研究〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(1)：41-3.

8Kuo JH，Chu YL，Yang JS.Cantharidin induces apoptosis in human bladder cancer TSGH 8301 cells through mitochondria-dependent signal pathways〔J〕.Int J Oncol，2010；37(5):1243-50.