狼瘡清顆粒對AHN模型大鼠腎功能和MRL/lpr小鼠腎組織NF-κBp65蛋白表達的影響

梁 濤 瞿凌晨 趙曉莉 梁 衛 呂高虹

(南京中醫藥大學藥理教研室，江蘇 南京 210023)

狼瘡性腎炎(LN)是系統性紅斑狼瘡(SLE)最常見的并發癥之一,幾乎所有SLE均有不同程度腎臟病變〔1〕。LN的發病機制目前一般認為是由于自身免疫功能紊亂,產生大量抗體,形成的免疫復合物沉積在腎小球基底膜和毛細血管壁，引起腎臟損傷〔2〕。本文研究的狼瘡清顆粒是從《備急千金要方》所載的犀角地黃湯中而來，具有清熱解毒、涼血化瘀、滋養陰液功效，本實驗擬研究其對LN是否具有治療作用,以期為狼瘡顆粒治療狼瘡腎炎提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1試驗藥物 狼瘡清顆粒：南京中醫藥大學提供,批號100726；潑尼松：天津藥業公司，批號：100309；弗氏完全佐劑:均為美國Sigma公司；尿蛋白、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)試劑盒：由南京建成生物有限公司提供；NF-κBp65一抗小鼠來源：Santa cruz提供；全蛋白抽提試劑盒,麗春紅染色液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒,一抗稀釋液，二抗稀釋液，內參一抗(β-actin一抗來源兔)，ECL檢測試劑盒，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，考馬斯亮藍染色法檢測蛋白試劑盒均為南京凱基生物科技發展有限公司提供。

1.2實驗動物 MRL/lpr小鼠、C57BL/6J小鼠：中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2007-004。Wistar大鼠由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2002-0053；實驗動物飼養許可證號：SCXK(蘇)2002-0012。

1.3儀器 Western電泳儀：Bio-Rad，America；高速冷凍離心機,美國科俊儀器公司；低溫冰箱：Sanyo，Japan；電熱恒溫干燥箱：上海潤東榮豐科學儀器有限公司；振蕩器：上海滬西分析儀器廠；多用脫色搖床：江蘇金壇市正基儀器廠；微量加樣器：Eppendorf；pH計：梅特勒-托麗多儀器公司；SyneRgy HT酶標儀：美國Bio-Tek。

1.4狼瘡清顆粒對主動型Heymann腎炎(AHN)大鼠模型腎功能影響

1.4.1抗原制備 取體重(150±20) g的Wistar大鼠,雌雄兼有,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,在無菌條件下剖開腹腔,結扎腎動脈,自結扎處向腎臟插管,剪斷腎靜脈,經插管用生理鹽水反復沖洗腎臟，使之成灰白色,取下腎臟,取腎皮質用電動勻漿器磨成勻漿,每次取皮質勻漿35 g,加弗氏完全佐劑70 ml,置乳缽研勻,緩緩加入生理鹽水140 ml邊加邊磨,使乳化均勻完全。

1.4.2模型制作 取體重(150±15) g的雄性Wistar大鼠，放入大鼠代謝籠中(每籠1只),收集24 h尿蛋白總量,除隨機抽取10只作正常對照組(正常組)外,其余大鼠腹腔注射上述同種大鼠腎皮質加弗氏完全佐劑液,每次2 ml/只,每2 w注射1次,共造模12 w,前后共注射7次,同時肌注硫酸慶大霉素注射液以預防感染。并于造模第8周同法收集24 h尿液,測定24 h尿蛋白。

1.4.3分組方法 取24 h尿蛋白量在20.07～41.37 mg之間的造模大鼠40只,按尿蛋白水平分層后隨機分為4組：模型組：給予其他組等體積蒸餾水；狼瘡清顆粒(中藥)組：給予狼瘡清顆粒(22.8 g/kg),狼瘡清顆粒+潑尼松(中藥+西藥)組：給予狼瘡清顆粒+潑尼松(22.8+0.005) g/kg，潑尼松(西藥)組：給予潑尼松(0.005 g/kg)。10只同批大鼠作為正常組給予等體積蒸餾水。灌胃連續4 w。

1.4.4觀察指標及檢測方法 ①尿蛋白、尿素氮、肌酐檢測：實驗結束,代謝籠收集24 h尿液，測定尿蛋白，眼眶取血，離心，收集血清，酶標儀測定BUN,Cr。②腎臟組織病理學觀察：大鼠處死后,取出腎臟,經腎門最大面切取1/2腎臟,10%甲醛固定,逐級酒精脫水、浸蠟、石蠟包埋,常規切片4 μm,PAS染色,Mias22000圖像分析儀分析。腎小球毛細血管壁厚度:隨機選擇 PAS染色腎小球數15個,觀察毛細血管壁厚度。分級標準為:(-)血管壁厚度沒有增加;(+)血管壁厚度增加數占總量的0%～25%;()血管壁厚度增加數占總量的26%～50%;()變性占總量的51%～75%;()變性占總量的76%～100%。

1.5對狼瘡性MRL/lpr小鼠NF-κBp65蛋白的表達的影響

1.5.1試驗方法及分組 取MRL/lpr小鼠20只，雌性，8周齡，飼養至90日齡，隨機分成4組，每組5只:模型組：MRL/lpr小鼠給予蒸餾水；狼瘡清顆粒(中藥)組：MRL/lpr小鼠給予狼瘡清顆粒(45.6 g/kg)；潑尼松(西藥)組：MRL/lpr小鼠給予潑尼松(0.01 g/kg)；狼瘡清顆粒+潑尼松(中藥組+西藥)組：MRL/lpr小鼠給予狼瘡清顆粒(45.6 g/kg)+潑尼松(0.01 g/kg)。正常對照組：C57BL/6J小鼠5只，給予蒸餾水。灌胃給藥,給藥體積0.1 ml/10 g,連續4 w。

1.5.2Western印跡檢測腎組織NF-κBp65蛋白的表達 灌胃給藥4周末將小鼠脫臼處死,迅速取出腎臟待測。采用Western 印跡的方法，進行SDS-PAGE凝膠電泳,步驟參照文獻。麗春紅染色顯示凝膠中的蛋白條帶后,轉移至PVDF膜上進行NF-κBp65蛋白的檢測。一抗NF-κBp65小鼠多克隆抗體(1∶200)和β-actin(1∶200)，二抗(辣根過氧化酶標記抗體,山羊抗小鼠多克隆抗體1∶5 000稀釋)。采用ECL化學發光試劑盒,顯影定影水洗晾干后,對膠片感光條帶進行灰度掃描。應用BIO-RAD圖像分析軟件對Western印跡雜交條帶進行密度掃描，以NF-κBp65條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示組織中NF-κBp65表達水平。

2 結 果

2.1對主動型 Heymann腎炎(AHN)大鼠腎功能影響 狼瘡清顆粒組、狼瘡清顆粒+潑尼松組、潑尼松組的BUN、Cr和尿蛋白水平均顯著低于模型組(P<0.05)，同時病理結果顯示：各給藥組大鼠腎小球毛細血管壁厚度、腎小管變性、與模型組大鼠相比均有不同程度的改善。見表1、表2。

表1 對主動型 Heymann腎炎(AHN)大鼠腎功能的作用

表2 AHN大鼠腎臟病理學觀察結果(n, n=10)

2.2對狼瘡樣MRL/lpr小鼠腎組織 NF-κBp65蛋白的影響 正常組NF-κBp65蛋白的表達(2.36±0.073 7),模型組(6.25±0.062 8)顯著增加(P<0.01)；與模型組相比較,狼瘡清顆粒組(4.30±0.059 1)、潑尼松組(4.17±0.042 9)、狼瘡清顆粒+潑尼松組(2.56±0.052 8)、NF-κBp65蛋白的表達顯著降低(P<0.01),其中狼瘡清顆粒與潑尼松合用NF-κBp65蛋白表達下降最明顯。

3 討 論

本實驗結果顯示給藥后各組降低24 h尿蛋白、血清BUN、Cr的含量。而24 h尿蛋白、血清Cr、BUN是衡量腎功能的重要指標，蛋白尿的輕重反映了腎小球基底膜的病變程度，另外腎臟病變時尿中異常出現的蛋白本身可能造成腎臟的損害,加重腎間質的炎癥反應并促進其纖維化〔3〕。當腎實質受損害時,腎小球濾過率降低后,血中Cr、BUN含量就會急劇上升，作為腎小球濾過功能和腎損傷的指標之一〔4〕。本結果提示我們狼瘡清顆粒具有改善AHN腎炎模型大鼠腎功能的作用。

NF-κB最初是從B淋巴細胞的核提取物中發現的一種能與免疫球蛋白κ鏈基因的增強子κB序列特異性結合的蛋白因子，最常見的形式是p65和p50蛋白亞基組成的二聚體,它廣泛參與許多基因(特別是免疫炎癥相關基因)的轉錄調控,包括白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、ICAM-1、IL-6、IL-15等細胞因子基因的表達,從而在免疫炎癥的病理過程中起重要作用〔5，6〕。近年來,對NF-κB在炎癥和免疫性疾病中的作用及相關藥物的作用機制研究成為抗炎免疫藥理學的一大熱門領域〔7〕。有研究表明〔8〕:NF-κB與狼瘡腎炎活動有密切聯系,可能參與了狼瘡腎炎的發病機制。因此,抑制NF-κB的過度活化很可能成為治療SLE分子機制的一個較好的靶點。本研究顯示:狼瘡清顆粒能抑制狼瘡小鼠腎臟組織中NF-κB蛋白的表達，可能是其治療狼瘡性腎病的機制之一。

4 參考文獻

1Cavallo T,Cameron WR,Lapenas D,etal.Immunopathology of early and silent lupus nephropathy〔J〕.Am J Pathol,1977;87:1-5.

2高春芳.系統性紅斑狼瘡小鼠模型的研究近況〔J〕.國外醫學·皮膚性病學分冊,1995;4(21)：212.

3史躍先.蛋白尿在慢性腎臟病中的作用〔J〕.中華腎臟病雜志，1997；(5):318.

4戚仁鐸.診斷學〔M〕.北京:人民衛生出版社,1990:36.

5Makarov SS.NF-κB as a therapeutic target in chronic inflammation：recent advances〔J〕.Molecul Med Today，2000;6:441-9.

6Pahl HL.Activators and target genes of Rel/NF-κB transcription factors〔J〕.Oncogene,1999;18:6853-8.

7向 明,吳 鐳,劉 屏.我國抗炎免疫藥理學研究的重要領域和發展趨勢〔J〕.中國藥理學通報,2003;19(2):138-9.

8許韓師,葉任高,張式鴻，等.NF-κB在狼瘡腎炎中的作用〔J〕.中華風濕病學雜志,2000;4(4):213-5.