左卡尼汀強化St.Thomas No.2液對老年大鼠離體供心冷保存的影響

周 濤 向道康 秦國偉

(貴州省人民醫院心血管外科，貴州 貴陽 550002)

供心質量是影響心臟移植手術成功的重要因素，也與術后遠期存活率密切相關〔1〕，供心保存的安全時限和保存方法是保證供心質量的關鍵，供心保存液的研究一直是心臟移植關注的熱點。左卡尼汀(LCN)廣泛分布于機體各種組織細胞中，是細胞能量代謝的重要調節因子，其作用是攜帶長鏈脂酰CoA通過線粒體內膜，促進三羧酸循環正常進行，協助細胞維持生理活動所需的能量生成，對心肌代謝途徑的調節具有非常重要的作用。我們早期的研究表明〔2〕使用含LCN的心臟停搏液可減輕心肌線粒體的脂質過氧化反應，對心肌細胞有較好的保護作用；進一步研究提示添加LCN的心臟停搏液可以減輕冷保存大鼠心肌線粒體的鈣超載，減輕心肌的氧化損傷，改善心肌的能量代謝，提高低溫離體心臟的保存效果〔3〕。本文利用Langendorff 灌注裝置建立老年大鼠離體心臟灌注模型，探討左卡尼汀強化St.Thomas No.2液對冷保存老年大鼠供心保存效果的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1動物分組及模型的建立〔3〕健康SD老年大鼠(20月齡)24只，雌雄各12只，使用隨機數字表法隨機分成3組,每組 8只，對照組組采用 St.Thomas No.2 液，主要成分(mmol/L)：氯化鈉120、氯化鉀16、氯化鎂16.6、氯化鈣1.2、碳酸氫鈉10，pH7.8，作為心臟停搏液并作為保存液保存心臟6 h，LCN1組、 LCN2組采用St.Thomas No.2液分別添加6、12 g/L LCN為心臟停搏液和保存液保存心臟6 h。

模型建立參考文獻〔4〕，老年大鼠稱重后腹腔注射肝素鈉抗凝，使用烏拉坦麻醉平穩后胸骨正中開胸，摘除心臟置入 4℃的K-H緩沖液中，沖洗主動脈內殘留血液，主動脈根部修剪后插入主動脈插管，與 Langendorff 裝置連接， K-H 緩沖液以灌注壓維持在90 cmH2O壓力、37℃恒溫灌流進行灌注，肺動脈根部切開以使冠狀動脈回流液充分引流。K-H緩沖液使用時新鮮配制，并經48 μm的過濾器過濾，灌注前給予95% O2和 5% CO2混合氣體按 1.5 L/min向儲液瓶內的灌流液中通氣30 min，平衡15 min左右心臟搏動達到穩定狀態，血流動力學平穩后測定血流動力學相關指標值,逐漸降低灌注溫度至 30℃以下，按分組經主動脈根部分別灌注不同的心臟停搏液使心臟停搏，取下停跳心臟，根據分組不同在相應的心臟保存液中分別保存6 h，重新開始心臟灌注，逐漸恢復灌注溫度至 37℃。

1.2實驗儀器與試劑 使用Langendorff離體心臟灌流裝置，美國AD Instruments公司ML870型PowerLab多導生理記錄儀，丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，其他試劑均為國產分析純試劑；LCN(商品名貝康亭)廣州貝氏藥業有限公司產品。

1.3標本采集及指標檢測 測定復灌至心臟復跳時間，在灌注恢復30 min、60 min后測定各血流動力學指標值，記錄心率(HR)、冠脈流量(CF)、左心室收縮峰壓 (LVSPP)、左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)，各項指標的恢復率按(保存后數值/保存前數值)×100%計算；灌注恢復30 min后取冠狀動脈流出液測定心肌酶乳酸脫氫酶(LDH)及磷酸肌酸激酶(CK)，LDH及CK使用全自動生化分析儀測定；心臟灌注恢復60 min后取2塊左心室心肌組織，一塊稱濕重后放入100℃的烘箱中烘烤，24 h后稱干重，按(濕重-干重)/濕重×100%計算心肌含水量，另一塊使用硫代巴比妥法測定MDA含量。

2 結 果

2.1心臟復跳時間及心功能指標的變化比較 各組離體心臟在冷保存6 h后均能成功復跳，對照組、LCN 1組和LCN 2組復跳時間依次為(85.31±12.09)s、(81.54±11.43)s和(79.80±13.47)s，見表1，三組之間比較無差異(P>0.05)。

2.2心肌含水量及MDA、心肌酶比較 三組心肌含水量比較，對照組〔(85.41±9.11)%〕較LCN 1組〔(77.09±7.21)%〕和LCN 2組〔(71.41±8.02)%〕高，LCN1組較LCN2高(P<0.05)；三組間MDA以對照組最高(P<0.05)，LCN1 、LCN2組比較無差別(P>0.05)；心肌酶CK、LDH濃度三組間比較差異有統計學意義(P<0.05),其中對照組漏出量最多(P<0.05)，LCN2組和LCN1組間比較，LCN1組較LCN2組漏出量較多(P<0.05)。見表1。

2.3心功能指標的變化 心臟灌注30 min時：LCN 2、LCN1組HR、CF恢復率較對照組高(P<0.05)， LVSPP和+dp/dtmax恢復率與對照組差異無統計學意義(P>0.05)， LCN2組和LCN1組間比較HR、CF 、LVSPP和+dp/dtmax恢復率恢復率差異無統計學意義(P>0.05)。心臟灌注60 min時：LCN1組LVSPP和+dp/dtmax恢復率恢復率較對照組高(P<0.05)，HR 、CF與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，LCN2組HR、 CF 、LVSPP和+dp/dtmax恢復率較LCN1組和對照組高(P<0.05)。見表2。

表1 各組心臟保存后心肌酶漏出量的情況

表2 各組心功能指標的變化比較

3 討 論

在器官移植手術中，器官保存液對于供體的保護作用至關重要，目前關于供體心臟保存液的類型及其灌注方法的選擇，國內外尚無統一標準〔5〕。 St.Thomas No.2液是最為經典也是目前臨床運用最廣泛的晶體心臟停搏液，在心臟移植的基礎研究和臨床使用上也有重要地位〔6〕，因此本研究使用St.Thomas液進行研究。低溫保存仍是目前最常用和最簡便的供體保存方法，當前各種器官保存液對器官保存的安全時間均有一定的限制，移植心臟保存的臨床安全期限一般為 4～6 h，因此本實驗設定保存離體心臟時限為6 h，對于老年供體心臟而言，本身不同的心肌結構特點以及可能存在的能量代謝障礙，對于保存質量的要求更為嚴格，左卡尼汀作為參與組織細胞能量代謝的重要物質，添加至St.Thomas No.2液中是否對老年心肌的保存有一定益處值得研究，本實驗觀察添加左卡尼汀對離體老年大鼠心臟低溫保存的效果，以觀察左卡尼可否改善St.Thomas No.2液對老年心肌的保存作用。

本實驗結果表明LCN添加入傳統的 St.Thomas No.2液配方中后，可以減輕離體心肌的損傷，心肌結構和心臟功能可以得到較好的保護，顯示出對老年大鼠離體心臟更好地保存效果，而且本研究同時表明，添加較大劑量的左卡尼汀組具有更好的保護效果。

移植早期心功能不全最主要的原因是移植心臟存在的缺血再灌注損傷，心肌缺血再灌注過程中氧自出基產生增加，自由基攻擊細胞內不飽和脂肪酸產生脂質過氧化反應，MDA是該反應過程的中間代謝產物，它的產生與脂質過氧化相平行，可反映機體內脂質過氧化程度，其水平高低可間接反映細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度。已有研究證實，LCN作為一種有效的氧自由基清除劑，在緩解氧化應激、減少脂質過氧化中均具有明顯的保護作用。本研究表明，使用添加LCN St.Thomas No.2液可以使再灌注心臟MDA產生減少，表明LCN可作為氧自由基清除劑減輕保存離體老年心臟恢復灌注時自由基損傷，可能為LCN對冷保存離體老年心臟具有保護作用的原因之一。

通常認為心肌缺血再灌注損傷過程是一種代謝失衡，心肌能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷發生的重要因素。LCN是人體能量代謝中必需的天然物質，在心肌的能量代謝中起重要作用〔7〕，同時LCN可以通過增加能量的產生而提高缺血缺氧組織的耐受能力。在體外循環心內直視手術中心臟停搏液添加一定量的LCN可以提供足夠量的游離卡尼汀，促進線粒體呼吸功能的恢復，改善缺血再灌注時的能量代謝障礙，優化心肌細胞能量代謝，減少缺血再灌注損傷，有助于減輕心肌細胞的損傷，促進心功能恢復〔2〕；我們早期的研究〔3〕表明LCN添加至St.Thomas No.2液可減輕長時間冷保存心肌線粒體鈣超載，改善線粒體呼吸功能，減輕三磷酸腺苷的降低，改善心肌能量代謝，對心肌細胞線粒體有較好的保護作用〔7〕，因此，在本實驗中添加LCN的心臟保存液可能有助于冷保存離體老年大鼠心臟能量代謝平衡，減少后繼的心肌缺血再灌注損傷，從而具有心肌保護效果。

4 參考文獻

1Goldsmith KA,Demiris N，Gooi JH,etal.Life-years gained by reducing donor heart ischemic times〔J〕.Transplantation，2009;87:243-8.

2向道康,閻興治,楊世虞,等.左卡尼汀對體外循環心瓣膜替換術心肌的保護作用〔J〕.中華醫學雜志,2003;83(21):1887-90.

3周 濤,向道康,秦國偉.左卡尼汀強化St.Thomas No.2液對長時間冷保存離體心臟能量代謝的影響〔J〕.中國心血管病研究,2010;8 (11)：851-4.

4Oyanagi E,Yano H,Kato Y,etal.L-Carnitine suppresses oleic acid-induced membrane permeability transition of mitochondria〔J〕.Cell Biochem Funct，2008;26(7):778-86.

5Lee S,Huang CS,Kawamura T,etal.Histidine-tryptophan-ketoglutarate or celsior：which is more suitable for cold preservation for cardiac grafts from older donors〔J〕?Ann Thorac Surg，2011；91(3):755-63.

6黑飛龍,王仕剛,于 坤,等.心臟移植心肌保護策略〔J〕.中國體外循環雜志,2009;7(3):166-8.

7Makrecka M，Kuka J，Liepinsh E,etal.The regulation of mitochondrial energy metabolism by L-carnitine lowering agents in ischaemia-reperfusion injury〔J〕.Heart，2011;97(24):e8.