ETV4在乳腺癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系

薛成軍 文娟娟 劉 藝 陳治水 袁 蓉 王勇軍 崔麗娟 陳 輝

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016)

ETS變異體(ETV)4作為ETS家族多瘤病毒增強(qiáng)子激活劑(PEA)3亞家族的一員，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，它的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。Firlej等〔1〕在動物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)抑制ETV4的表達(dá)可以減慢乳腺癌細(xì)胞株的增殖和轉(zhuǎn)移；反之，上調(diào)其表達(dá)則對乳腺組織產(chǎn)生致瘤作用。已有研究證實(shí)脯氨酸羥化酶(PHD)2在黑色素瘤的血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用〔2〕。Wollenick等〔3〕利用核酸分子雜交和熒光共振能量轉(zhuǎn)化分析技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)ETV4可以激活PHD2。本文探討ETV4在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及病理分型等方面的作用。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集我院2011年10月至2012年5月資料完整的女性乳腺癌手術(shù)組織標(biāo)本97例，年齡28～83〔平均(52.9±12.8)〕歲。并隨機(jī)取離腫塊5～7 cm的正常組織10例作為陰性對照。組織學(xué)類型：浸潤性導(dǎo)管癌87例，其他10例(包括導(dǎo)管內(nèi)癌3例，浸潤性小葉癌3例，乳頭狀腺癌4例)。按國際抗癌聯(lián)盟2010年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期37例，Ⅱ期36例，Ⅲ期24例，Ⅳ期0例。病理學(xué)分級：Ⅰ級24例，Ⅱ級31例，Ⅲ級42例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診，且手術(shù)前均未接受過化療和放療等針對性治療。

1.2試劑 鼠抗人ETV4單克隆抗體(濃縮液)購自英國Abcam公司(貨號：ab70425)。CD34、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、Ki-67和HER2/neu的鼠抗人單克隆抗體(即用型)均購自中杉金橋公司。

1.3方法 采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)染色三步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。制片：組織標(biāo)本以10%甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，貼附于經(jīng)APES處理的載玻片，60℃烤片2 h。染色：①常規(guī)脫蠟脫水；②滴加過氧化物酶阻斷液(37℃封閉10 min)，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；③pH6.0檸檬酸緩沖液高溫高壓行抗原修復(fù)，PBS沖洗，5 min×3次；④5%山羊血清封閉，室溫孵育5 min，傾去血清，PBS沖洗，5 min×3次；分別滴加ETV4(1∶200稀釋)，CD34、ER、PR、Ki-67和HER2/neu一抗工作液，4℃冰箱過夜，PBS沖洗，5 min×3次；⑤滴加IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3次；⑥D(zhuǎn)AB顯色；⑦自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 光鏡下每張切片中選取癌細(xì)胞較多的5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。染色強(qiáng)度分級如下：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；陽性細(xì)胞數(shù)分級為：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0，10%～25%為1，25%～50%為2，>50%為3，兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥3為陽性表達(dá)病例。ER、PR、Ki-67、HER2/neu陽性標(biāo)準(zhǔn)參照試劑操作說明判定。微血管密度(MVD)計數(shù)方法：用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，參照Weidner計數(shù)法〔4〕，由兩位不知道臨床資料的病理醫(yī)師在低倍鏡(×10)下找到3個血管最密集區(qū)域，再在高倍鏡(×40)視野下計數(shù)微血管數(shù)目。凡單個孤立的或多個緊密排列的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，只要與鄰近腫瘤細(xì)胞及周圍結(jié)締組織成分分界清楚，不論有無血管腔，即可計數(shù)為1 個微血管數(shù)，但應(yīng)忽略管腔直徑>8個紅細(xì)胞或管壁有平滑肌存在的血管。取3個視野的微血管數(shù)的平均值作為該標(biāo)本的MVD。兩位病理醫(yī)師計數(shù)差異10%以上者需重新計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織中ETV4的表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系 43.3%的乳腺癌組織中ETV4呈陽性表達(dá)。顯微鏡下，乳腺癌細(xì)胞的胞核和(或)少部分胞質(zhì)中，ETV4呈陽性表達(dá)；癌旁細(xì)胞則呈陰性表達(dá)。見圖1。ETV4的陽性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級和TNM分期存在正相關(guān)(r=0.249，P<0.05，r=0.263，P<0.05；r=0.316，P<0.01；r=0.255，P<0.05)；但與患者的年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

2.2乳腺癌組織ETV4的表達(dá)與微血管密度之間的關(guān)系 顯微鏡下，CD34主要表達(dá)于乳腺癌組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞。見圖2。ETV4(+)乳腺癌組織的MVD高于ETV4(-)乳腺癌組織的MVD(47.6±15.7 vs 34.6±10.9，P<0.01)。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，ETV4的表達(dá)與MVD呈顯著性正相關(guān)(r=0.247，P<0.01)。

2.3ETV4與現(xiàn)有乳腺癌病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，在乳腺癌中，ETV4的表達(dá)與HER2/neu的表達(dá)和Ki-67的增殖指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.241，P<0.05；r=0.253，P<0.05)，但與ER和PR的表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

圖1 ETV4在乳腺癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)(SP，×200)

表1 乳腺癌組織中ETV4表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征間的關(guān)系〔n(%)〕

圖2 CD34在不同乳腺癌組織中的表達(dá)情況(SP，×100)

表2 乳腺癌組織ETV4表達(dá)與ER、PR、HER2/neu、Ki-67之間的相關(guān)性分析〔n(%)〕

3 討 論

ETS最早是由美國Frederick國家癌癥研究所分子腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室在鳥骨髓成紅細(xì)胞增多癥病毒E26的基因序列中發(fā)現(xiàn)的。ETV4作為ETS家族PEA3亞家族中的一員，也曾被稱為腺病毒E1A增強(qiáng)子結(jié)合蛋白。通過對ETV4轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的分析，發(fā)現(xiàn)它在人類胚胎期和成年期的多種器官的正常組織中都有低水平的表達(dá)。在乳腺正常組織和癌組織的對比研究中，通過檢測ETV4的mRNA水平發(fā)現(xiàn)兩者之間有明顯差異，并認(rèn)為ETV4在乳腺癌發(fā)生的基因調(diào)節(jié)過程中可能起到關(guān)鍵作用。Baker等〔5〕通過對MMTV/Wnt1轉(zhuǎn)基因鼠的研究中發(fā)現(xiàn)沉默ETV4基因可以延緩乳腺癌的發(fā)生時間和生長速度。本研究結(jié)果表明ETV4在乳腺癌發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著重要作用。Yuen等〔6〕在原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞的研究中，進(jìn)一步證實(shí)ETV4和乳腺癌的病理學(xué)分級和預(yù)后相關(guān)。

許多研究證實(shí)，惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)。目前，在腫瘤血管生成方面的研究中，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物測量腫瘤MVD是公認(rèn)的能夠代表腫瘤血管生成狀態(tài)的方法。其中CD34是重復(fù)性較好的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物〔7〕。來自腎臟形態(tài)發(fā)生方面的研究表明，ETV4能促進(jìn)上皮細(xì)胞出芽并進(jìn)一步形成脈管樣結(jié)構(gòu)，并通過一個復(fù)雜的通路與周圍的組織間質(zhì)產(chǎn)生相互作用〔8〕，提示ETV4在血管的形成中可能發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果提示ETV4與乳腺癌組織中的血管生成有密切關(guān)聯(lián)。相關(guān)的基礎(chǔ)研究均支持本研究結(jié)果，Wollenick等〔3〕應(yīng)用免疫共沉淀的方法，發(fā)現(xiàn)ETV4可以與缺氧誘導(dǎo)因子-1α一起作用于PHD2的啟動子，刺激它的表達(dá)；而PHD2是在惡性腫瘤的血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因〔9〕。然而，Chen等〔10〕則證實(shí)ETV4的過表達(dá)可以增強(qiáng)白細(xì)胞介素(IL)-8的啟動子的活性，從而上調(diào)其表達(dá)，而IL-8屬于炎癥趨化因子，屬于缺氧誘導(dǎo)因子-1α的下游因子，在腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究雖然通過臨床標(biāo)本觀察到了ETV4與乳腺癌微血管生成之間的關(guān)系，至于ETV4是通過何種通路發(fā)揮作用，本課題組將開展進(jìn)一步研究。

HER2/neu屬于表皮生長因子受體家族，與乳腺癌的發(fā)生，轉(zhuǎn)移和藥物抵抗相關(guān)聯(lián)，并在人類20%～30%的乳腺癌中存在拷貝數(shù)增加和過表達(dá)〔11〕。在轉(zhuǎn)基因鼠的研究中，已證實(shí)ETV4是HER2/neu表達(dá)過程中不可或缺的一部分，并提示它可能是HER2/neu蛋白的下游效應(yīng)因子。本研究顯示，乳腺癌組織中ETV4過表達(dá)與HER2/neu的過表達(dá)存在正相關(guān)，與斯向東等的報道一致〔12〕。但是，Xia等〔13〕在2006年的報道認(rèn)為ETV4在乳腺癌中的表達(dá)與HER2/neu無相關(guān)性。這一矛盾不排除與方法學(xué)的進(jìn)步有關(guān)，因?yàn)榻陙碓诜肿铀降难芯刻崾綡ER2/neu和ETV4之間可能存在一個惡性循環(huán)，HER2/neu可以激活ETV4轉(zhuǎn)錄因子的活性，而ETV4轉(zhuǎn)錄因子反過來可以通過結(jié)合HER2/neu基因的啟動子而激活它轉(zhuǎn)錄。

Ki-67抗原為細(xì)胞核內(nèi)分裂增殖相關(guān)蛋白，在細(xì)胞周期S、G1、G2、M期均有表達(dá)，G0期缺如，常作為腫瘤細(xì)胞增殖活性的可靠標(biāo)記。Ki-67的表達(dá)能敏感地反應(yīng)惡性腫瘤的增殖情況，與多種惡性腫瘤的發(fā)展，轉(zhuǎn)移和與預(yù)后有關(guān)〔14〕。本研究在國內(nèi)首次報道ETV4的表達(dá)與Ki-67增值率呈顯著性正相關(guān)，推測：ETV4和Ki-67可能擁有共同信號通路，并作為分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的下游基因在乳腺癌的增殖過程中共同發(fā)揮作用。因?yàn)镋TV4被激活較公認(rèn)的通路是：HER2/neu-RAS-RAF-MEK-MAPK-PEA3〔15〕，即MAPK激活包括ETV4在內(nèi)的所有PEA3轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員。黃坊等〔16〕在鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的研究中也發(fā)現(xiàn)，Ki-67與MAPK成明顯正相關(guān)，并認(rèn)為Ki-67可能是MAPK的下游基因。

由于ETV4在乳腺癌組織中高表達(dá)，并與乳腺癌組織的血管生成和乳腺癌患者的臨床特征高度相關(guān)，本研究認(rèn)為，深入研究ETV4與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是與血管生成的分子機(jī)制，將為乳腺癌的基因治療、化療新藥的設(shè)計和實(shí)驗(yàn)室生物標(biāo)志等方面開辟新的思路。

4 參考文獻(xiàn)

1Firlej V，Ladam F，Brysbaert G，etal.Reduced tumorigenesis in mouse mammary cancer cells following inhibition of Pea3-or Erm-dependent transcription〔J〕.Cell Sci，2008；121(20)：3393-402.

2Spinella F，Rosanò L，Del DM，etal.Endothelin-1 inhibits proly1 hydroxylase domain 2 to activate hypoxia-inducible factor-1 alpha in melanoma cells〔J〕.PLoS One，2010；5(6):e11241.

3Wollenick K，Hu J，Kristiansen G，etal.Synthetic transactivation screening reveals ETV4 as broad coactivator of hypoxia-inducible factor signaling〔J〕.Nucleic Acids Res，2012；40(5)：1928-43.

4Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pzza F，etal.Tumor angiogensis：a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma〔J〕.J Natl Cancer Inst,1992；84(24):1875-87.

5Baker R，Kent CV，Silbermann RA，etal.Pea3 transcription factors and wnt1-induced mouse mammary neoplasia〔J〕.PLoS One,2010；5(1):1765-73.

6Yuen HF，Chan YK，Grills C,etal.Polyomavirus enhancer activator 3 protein promotes breast cancer metastatic progression through snail-induced epithelial-mesenchymal transition〔J〕.J Pathol，2011；224(1):78-89.

7周歷安.乳腺癌彩色多普勒血流表現(xiàn)與術(shù)后組織中血管內(nèi)皮生長因子和血管密度的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(9):1831-2.

8Lu BC，Cebrian C，Chi X，etal.Etv4 and Etv5 are required downstream of GDNF and ret for kidney branching morphogenesis〔J〕.Nat Genet，2009；41(12):1295-302.

9Chan DA，Kawahara TL，Sutphin PD,etal.Tumor vasculature is regulated by PHD2-mediated angiogenesis and bone marrow-derived cell recruitment〔J〕.Cancer Cell，2009；15(6):527-38.

10Chen Y，Chen L，Li JY，etal.ERβ and PEA3 co-activate IL-8 expression and promote the invasion of breast cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther，2011；11(5):497-511.

11Hojati Z，Orangi E.HER2/neu gene amplification assessment in breast cancer patients in Isfahan province by real time PCR，differential PCR and immunohistochemistry〔J〕.Gene,2012；497(2):237-42.

12斯向東，唐劍敏，沈晶瑩，等.PEA3蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與HER2/neu的關(guān)系〔J〕.中國癌癥雜志,2011；21(10):766-70.

13Xia WY，Lien HC，Wang SC，etal.Expression of PEA3 and lack of correlation between PEA3 and HER2 /neu expression in breast cancer〔J〕.Brest Cancer Res Treat,2006；98(3):295-301.

14Fracalossi AC，Comparini L，F(xiàn)unabashi K,etal.Ras gene mutation is not related to tumour invasion during rat tongue carcinogenesis induced by 4-nitroquinoline 1-oxide〔J〕.J Oral Pathol Med，2011；40(4):325-33.

15Guo B，Panagiotaki N，Warwood S，etal.Dynamic modification of the ETS transcription factor PEA3 by sumoylation and p300-mediated acetylation〔J〕.Nucleic Acids Res，2011；39(15)：6403-13.

16黃 坊,謝 明,景志亮,等.ERK/MAPK信號通路活性表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)系〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2010；17(15):1192-5.