氨基胍與Baicalein對糖尿病大鼠腦微血管重塑的影響

王 瓊 李惠勉

(鄭州大學第二附屬醫院干部病房，河南 鄭州 450014)

糖尿病(DM)是腦血管病的重要危險因素，其發生缺血性腦卒中的危險性高〔1〕，DM腦血管病在大血管及微血管上均有累及，資料顯示DM性腦血管病是由高血糖、蛋白質非酶糖化、血脂代謝紊亂、血液流變學異常、血小板功能異常等相關因素所致〔2〕。目前國內外在心、肺、肝、腎及視網膜等臟器的血管重塑方面研究較多，而對DM引起的腦血管重塑方面的研究甚少。氨基胍(AG)是一種糖基化終末產物(AGEs)拮抗劑，它可以明顯抑制AGEs的生成，改善高血糖、血脂所引起的血管形態結構的改變。Baicalein是中藥黃芩的主要提取物，具有抗氧化、抑制血管平滑肌增生等作用。本實驗通過建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，應用AG和Baicalein對DM大鼠進行干預，探討二者對DM大鼠腦微血管結構重塑的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器 8～9周齡SD大鼠48只，體重180～200 g(鄭州大學實驗動物中心)，鏈脲佐菌素(STZ)和AG(美國sigma公司)，Baicallein(上海楷洋生物技術有限公司)，One-Touch-Ⅱ型血糖儀及試紙(美國強生公司)，JEM-100SX透射式電子顯微鏡(日本日立公司茨城縣NAKA工廠，西安交通大學電鏡室提供)，CD34鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉生物工程公司)。

1.2DM動物模型的制備及分組 48只SD大鼠隨機分為AG組、Baicalein組、DM組、對照組，每組12只，對照組給予普通飲食喂養； 其余三組按照文獻〔3〕建立DM大鼠模型，AG組、Baiclien組、DM組給予高脂高糖飲食(10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽鹽，66.5%普通飼料)喂養，6 w后，AG組、Baicalein組及DM組大鼠禁食不禁水12 h后，于左下腹部腹腔注射30 mg/kg STZ溶液(臨用前用0.1 mol/L，pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成2%的溶液，避光進行，現配現用)，對照組腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液，72 h后尾靜脈采血，用OnETOUcH血糖儀測定血糖，以隨機非空腹血糖>16.7 mmol/L定為DM模型，造模成功后，AG組、Baicalein組分別給予AG溶液、Baicalein溶液灌胃，劑量均為150 mg·kg-1·d-1，DM組，對照組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均飼養16 w，檢測血糖、觀察病情。

1.3電鏡觀察 16 w末，各組大鼠用10%水合氯醛(250 mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸，用穿刺針小心插入左心室，同時剪開右心耳，生理鹽水10 ml經心臟快速灌注，直至流出液體變清，再用4%多聚甲醛+2.5%戊二醛先快后慢灌注固定30 min，直到大鼠全身僵硬為止，開顱取出全腦，去掉腦干和小腦，取大腦皮層中部，切成1 mm3的組織塊，立即置于2.5%的戊二醛固定液中4℃固定，1%四氧化鋨固定液4℃后固定，乙醇梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋，聚合后作半超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射式電子顯微鏡(×30 000)下觀察、拍照。

1.4CD34免疫組化染色及微血管計數 大鼠腦組織取材方法同電鏡，取出全腦，去掉腦干和小腦后，4%多聚甲醛固定8 h，常規石蠟包埋切片，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗3次，浸泡5 min/次，室溫滴加3%H2O220 min，PBS沖洗3次，5 min/次， SP試劑盒說明書進行操作，一抗(CD34,1∶100)DAB顯色，鏡下控制顯色時間，梯度酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片。微血管密度計數方法：參照Weidener〔4〕等的計數方法，每張切片隨機選取5個高倍(×200)視野下進行微血管計數，計算每平方毫米面積內的微血管數量，取平均值。

2 結 果

2.1各組大鼠微血管透射電鏡觀察結果 對照組毛細血管腔規則，細胞核內染色質分布均勻，核仁可見；基底膜結構清晰。DM組毛細血管形態不規則，部分血管管腔狹窄、變形，血管周圍膠質細胞腫脹、溶解，血管內皮細胞腫脹，細胞核內染色質凝集、邊集，核仁少見；細胞質內細胞器較少，線粒體腫脹，呈空泡樣改變，基底膜結構不清晰。AG組毛細血管腔內空曠，結構完整，部分血管形態不規則，血管內皮細胞輕度腫脹，基底膜結構略清晰；細胞質內線粒體輕度腫脹，部分細胞內及細胞間可見大量空泡。Baicalein組血管內皮細胞結構清晰，細胞核呈卵圓形，核內染色質輕度凝集；其基底膜結構完整，血管周圍可見膠質細胞，神經細胞仍有腫脹，細胞核呈圓形，核內常染色質豐富，核仁明顯；細胞質內線粒體輕度腫脹。見圖1。

2.2各組大鼠CD34免疫組化檢測結果 AG組〔(22.45±3.05)個〕、Baicalein組〔(23.9±2.42)個〕、DM組〔(18.7±2.87)個〕與對照組〔(25.8±2.48)個〕比較，前三組CD34表達微血管數量減少(P<0.01),DM組CD34表達的微血管數較AG、Baicalein兩組明顯減少(P<0.01)；AG、Baicalein兩組比較，CD34表達微血管數無顯著性統計學差異(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠透射電鏡下腦組織微血管形態學結構(×30 000)

圖2 各組大鼠腦血管CD34免疫組化表達(×200)

3 討 論

DM性腦血管病是因DM引發的腦血管病，在糖、脂肪、蛋白質等一系列代謝紊亂的基礎上，所引起的顱內大血管和微血管病變〔5〕。血管壁可以感知周圍環境的變化，并對刺激做出反應，調節其管壁下生物學行為以維持血管功能的平衡，若平衡被打破，可造成血管結構的改變，即發生“血管重塑”〔6〕。DM血管重塑包括：①血管內膜下間隙和中層細胞總體積及細胞外基質(ECM)增加造成的，稱為生長；②血管總體積不變，但組成成分重新排列導致血管內外徑縮小，血管壁增厚，把這種現象的重構稱為嚴格意義上的重塑〔7〕。DM血管重塑既是DM血管的病理改變，又是發生血管并發癥如動脈粥樣硬化及微血管病變的結構基礎。影響DM血管重塑因素很多，其中，在高血糖環境下與體內不同蛋白質在非酶解作用下形成AGEs的異常作用是血管重塑影響因素中主要因素之一〔8,9〕，AGEs主要通過與其特異性AGE受體(RAGE)結合，啟動MAP激酶(MAPK)及核轉錄因子(NF-κB)信號通路(細胞增殖與炎癥)、Ras通路(應激與細胞凋亡)、Rac/Cdc42通路(細胞生長與運動)以及Jak/Stat通路(基因表達調控)等〔10〕，上調多種生長因子如轉化生長因子(TGF)-β、堿性成纖維生長因子(bFGF)等，黏附分子如細胞間黏附分子(ICAM)-1等以及纖溶酶原活化抑制因子(PAI)-1等基因的表達〔11〕,促進細胞增殖，血管通透性增加，內皮素的形成，增加Ⅳ型膠原、蛋白聚糖及纖維的合成，導致ECM擴張，血管基底膜增厚，微血管血液瘀滯甚至閉塞等血管病變。此外AGEs可造成分子重排、參與氧化應激等多種機制引起血管損傷和功能的改變〔12〕。

研究發現，內皮細胞功能障礙的程度與血管重塑的性質呈相關性，在血管重塑的模型中觀察到內皮損傷程度越重，管壁增厚，管腔狹窄越明顯。動脈粥樣硬化及血管移植的病人中也發現了血管重塑與嚴重的內皮細胞功能障礙有關〔13,14〕，即證實血管內皮功能障礙越嚴重，預示血管重塑向負性方向發展，不利于疾病進程。DM時，內皮細胞功能紊亂引起的微血管重塑，與蛋白激酶C(PKC)被激活有關。PKC是一種重要的細胞內信號通路。PKC的激活進一步引起一系列的病理改變： eNOS的活性的降低，一氧化氮(NO)產生和分泌的減少，血管內皮素(ET-1)的釋放，引起血管舒縮功能障礙〔15〕；血管內皮生長因子(VEGF)的表達，新生血管的形成，血管通透性的增強，ICAM-1、血管黏附分子(VCAM-1)和E-選擇素升高，使得白細胞與內皮細胞的黏附增加，加重血栓的形成；TGF-β1的表達水平上調，增加纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的表達，引起ECM增生。上述因子的改變均可加重微血管重塑，因此選擇敏感的微血管內皮細胞標志物，反映微血管重塑的嚴重程度，對微血管重塑的治療尤為重要。CD34又稱人原始造血細胞抗原，是一種高度酸性的Ⅰ型糖基化單鏈跨膜糖蛋白，其分子量為105～120 kD，微血管形態學研究發現CD34內皮細胞抗原在毛細血管、小血管內皮細胞呈強陽性，且CD34標記的微血管顯影效果良好，背景染色淺，Hollongsworth等〔16〕認為CD34是目前血管內皮細胞最可靠的標志物。因CD34在正常組織中的所有血管內皮細胞均有表達且色澤最深，便于微血管數量的計數〔17〕，因此，實驗中選擇CD34作為檢測微血管數量的指標，反應微血管損傷的程度，進而判斷腦微血管重塑的嚴重程度。本研究結果提示CD34表達愈少，微血管數量減少的愈多，微血管內皮細胞受損愈多，微血管重塑愈重。

AG是一種非酶糖基化終產物(AGEs)抑制劑，是一種親核的肼類化合物，可以抑制AGEs的形成。AGEs是長期高血糖引起的糖與蛋白質中的氨基發生非酶糖基化產生的，經糖基化修飾的蛋白質發生功能性的改變，使得血管基底膜發生變構，直接損傷血管內皮，促進平滑肌細胞的增殖，加快血小板聚集和血栓形成。研究〔18〕表明,AG可以抑制AGEs的形成，在延緩DM腎病、DM視網膜病變、蛋白尿等都顯示出良好的療效。本實驗中應用AG對DM大鼠進行了干預，電鏡觀察結果提示AG可以減輕腦微血管結構的損傷，減輕血管狹窄，抑制微血管重塑。免疫組化法結果提示應用AG后，腦組織微血管數量得到了改善，同時也反映了其對微血管重塑的抑制作用。

Baicalein是中藥黃芩提取的黃酮類化合物，近年來，很多研究發現這類化合物在抗氧化、抗炎等方面有一定的成效〔19～21〕，本實驗結果提示Baicalein同樣可在一定程度上減輕DM腦微血管的損害，抑制微血管重塑，因而具有一定的保護腦血管的作用，且Baicalein價格低廉，藥源充足，毒副作用小，故對其進行研究可能具有較大的臨床應用價值。

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