絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細胞胰島素蛋白表達的作用

李 健 劉東慧 宋成軍 陳志宏

(承德市中心醫院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

2型糖尿病(T2DM)致殘率、致死率較高，并且超過85%〔1〕。T2DM主要以血糖升高、胰島素抵抗以及胰島β細胞功能受損等為主要特征〔2，3〕。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)制T2DM大鼠模型，觀察絲膠對模型大鼠胰島β細胞胰島素蛋白表達的作用，探討絲膠保護糖尿病時胰島β細胞損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物的選擇及分組處理 36只3月齡清潔級健康雄性SD大鼠，體質量200～250 g(合格證號：712024)，購自河北醫科大學實驗動物學部。隨機選取其中的12只作為正常對照組，常規飼養，腹腔注射同等劑量STZ溶劑(pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小劑量STZ連續腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg)3 d，7 d后檢測空腹血糖，以≥16.7 mmol/L作為T2動物模型成功的標準〔4〕。成模大鼠隨機分為糖尿病模型組和絲膠治療組(n=12)，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d；正常對照組、模型組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃35 d。

1.2藥物與試劑 STZ(美國Sigma公司)臨用前用pH4.4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成2%的溶液；血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；兔抗胰島素多克隆抗體，美國Santa Cruz公司，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。絲膠，彩色蠶繭(承德醫學院蠶業研究所提供)經浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。

1.3檢測血糖 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經內眥取血，3 000 r/min離心20 min后分離血清，-20℃保存。采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4檢測胰島β細胞胰島素蛋白的表達 大鼠取血后斷頭處死，取胰腺Bouins液固定后常規石蠟包埋，Leica石蠟切片機連續切片，片厚5 μm。免疫組化SP法觀察胰島β細胞胰島素蛋白的表達：一抗稀釋濃度為1∶400，4℃孵育過夜；二抗(工作液)37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染細胞核。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞質中出現棕黃色顆粒為胰島素蛋白免疫陽性反應。胰島素蛋白免疫陽性結果定量分析：采用MiVnt圖像分析系統在顯微鏡下(10×40倍)隨機選取胰島作為觀察視野，計算陽性產物面積占胰島面積的比值。每組隨機選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個胰島，取平均值。

1.5統計學方法 應用SPSS16.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠的血糖 絲膠治療組大鼠的血糖均明顯低于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠的血糖和胰島β細胞胰島素蛋白的表達

2.2各組大鼠胰島β細胞胰島素蛋白的表達 胰島素蛋白免疫陽性產物為棕黃色顆粒狀，位于胰島β細胞胞質見圖1。胰島素蛋白定量分析結果見表1：與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠胰島β細胞胰島素蛋白的表達明顯降低(P<0.01)；絲膠治療組大鼠胰島β細胞胰島素蛋白的表達明顯高于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組大鼠胰島β細胞胰島素蛋白的表達(免疫組化染色，×400)

3 討 論

STZ致糖尿病的機制是其能夠直接特異性殺傷胰島β細胞，并且小劑量多次注射STZ可導致T2DM〔5，6〕。STZ具有活潑的羥基結構，可直接損傷胰島β細胞的DNA，并刺激β細胞釋放過氧化氫，過量的過氧化氫及其轉化生成的羥自由基還可通過增加脂質過氧化物的水平抑制胰島素釋放。STZ還有亞硝基基團，可產生一氧化氮，一氧化氮通過參與多種自由基級聯式反應，誘導胰島β細胞凋亡；同時，一氧化氮還能抑制胰島β細胞線粒體的功能，降低胰島素的分泌〔7〕。

胰島素是胰島β細胞分泌的機體內唯一降低血糖的激素，主要作用是促進物質合成，因此又被稱為“儲存激素”，在調節機體糖、脂肪和蛋白質代謝方面具有重要作用〔8〕。糖尿病時胰島β細胞破壞或功能減退，胰島素分泌不足或缺乏，糖進入組織細胞貯存及在細胞內氧化利用發生障礙，從而導致血糖升高及一系列相關的病理生理變化〔9〕。另外，糖尿病時胰島素分泌不足，導致蛋白質分解增加、合成受限，體內蛋白質出現負平衡〔10〕；同時，由蛋白質分解釋放到血漿中的戊糖氨基酸如丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸等水平升高，被肝臟攝取轉化為葡萄糖，進一步導致血糖的升高〔11〕。

中國傳統醫學認為糖尿病屬“消渴癥”，以生精清熱、潤燥養陰等為治療原則。蠶繭為蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，可滋陰潤燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。民間有蠶繭泡水降血糖的驗方，本文前期研究亦發現，絲膠(彩色蠶繭水提取物)可明顯降低血糖和調節血脂代謝紊亂，保護糖尿病時生殖功能障礙〔12～14〕。本研究發現，絲膠可通過提高胰島β細胞胰島素蛋白的表達，恢復胰島β細胞的功能并增加胰島β細胞分泌胰島素，從而有效降低血糖，并改善糖尿病時3大物質代謝紊亂，有效緩解糖尿病及其并發癥的發生和發展。由于絲膠是天然的蛋白質，可避免化學合成藥物帶給人體的毒副作用，因此可能具有良好的推廣應用前景，但相關機制有待進一步的深入研究。

4 參考文獻

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