缺氧卵巢癌細(xì)胞分化過程中LSD1表達(dá)的改變

薛端陽 張 潔 汪曉鶯 馬 艷 魏煒煒

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226019)

血管擬態(tài)(VM)是指具有高度侵襲性的腫瘤細(xì)胞可以通過自身的伸展、變形形成血管樣細(xì)胞，這種腫瘤的特點(diǎn)就是具有高度可塑性。VM已在多種類型的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，而往往VM的發(fā)生都與不良的預(yù)后相關(guān)，可能受相關(guān)修飾酶的表遺傳調(diào)控。LSD1是一種重要的表遺傳調(diào)控酶類，具有組蛋白H3第4位賴氨酸二位去甲基化酶活性〔H3K4(2m)〕和組蛋白H3第9位賴氨酸去甲基化(H3K9)酶活性，從結(jié)構(gòu)上來看，LSD1的C端2/3區(qū)域與FAD依賴性胺氧化酶有高度的序列同源性，其N端含一個(gè)SWIRM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是蛋白-蛋白相互作用基序。SWIRM結(jié)構(gòu)域使得LSD1及其家族與傳統(tǒng)的胺氧化酶有所不同，在生物發(fā)育中扮演著重要的角色。目前LSD1在腫瘤發(fā)生中的研究主要集中在對(duì)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的影響，尚未見到LSD1對(duì)于相關(guān)腫瘤細(xì)胞形成VM能力的報(bào)道。本文初步探討LSD1分子在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移上的作用。

1 材料與方法

1.1試劑及主要儀器 RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Trypsin) 、胎牛血清(FBS) 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO) 為天津化學(xué)試劑二廠產(chǎn)品；余為國(guó)產(chǎn)分析醇。二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO 公司產(chǎn)品。An Thos TH2酶標(biāo)儀為Austria公司生產(chǎn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和MTT 缺氧和對(duì)照組的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48小時(shí)換液1次，0.25% 的胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將SKOV3細(xì)胞株分為對(duì)照組、缺氧組。對(duì)照組為未處理的SKOV3細(xì)胞株。采用MTT法測(cè)定72 h的細(xì)胞增殖的抑制效率，用0.25%的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株SKOV3，制成4×104/ml細(xì)胞懸液，以每孔200 μl接種于兩個(gè)96孔板。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的492 nm吸光度OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。

1.3細(xì)胞缺氧誘導(dǎo) 將接種的細(xì)胞置于GENbox Jar2.5L厭氧盒中，持續(xù)充以混合氣體(5%CO2+1%O2+94%N2)，壓力為0.1 mPa，氣體從容器的另一孔排出，模擬1%CO2的缺氧環(huán)境。

1.4Matrigel膠三維培養(yǎng) 將Matrigel與RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含OVCAR-3細(xì)胞數(shù)約1×104)按1∶3混合，滴入24孔培養(yǎng)板，每孔150 μl，37℃孵育30 min凝膠，建立Matrigel膠三維培養(yǎng)系統(tǒng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OVCAR-3(每孔1×105個(gè))單細(xì)胞懸液接種于Matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)，分別在常氧(常氧組)、缺氧(1%O2，缺氧組)等條件下培養(yǎng)。每隔48 h換液，培養(yǎng)7 d，相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察擬態(tài)血管形成情況并攝片。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中LSD1表達(dá)和H3K4(2m)去甲基化酶活性 取常氧和缺氧條件下培養(yǎng)7 d的OVCAR-3細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞裂解液500 μl， 輔以細(xì)胞刮刀于冰上裂解細(xì)胞，0℃離心5 000 r/min×10 min，取上清，-80 ℃凍存。SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)，一抗山羊抗人(LSD1，山羊抗人H3K4(2m)1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，將轉(zhuǎn)印膜放入用10%脫脂奶粉的TBST稀釋的HRP耦聯(lián)的二抗(1∶750)中，洗膜、顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1缺氧條件下Matrigel三維培養(yǎng)OVCAR-3細(xì)胞形成VM 利用Matrigel膠三維培養(yǎng)觀察VM的形成情況。常氧條件下， OVCAR-3細(xì)胞雖能出現(xiàn)長(zhǎng)條形伸展或細(xì)胞質(zhì)有多個(gè)突起，部分表現(xiàn)出條索狀和不規(guī)則橢圓形等改變，但不能形成上述管道樣結(jié)構(gòu)。缺氧條件培養(yǎng)下， OVCAR-3細(xì)胞浸潤(rùn)在Matrigel上疊加生長(zhǎng)，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，部分細(xì)胞逐漸伸展、變形，呈長(zhǎng)條形或弧形，7 d后細(xì)胞與細(xì)胞之間開始相互連接，并能形成腔樣、管狀、分支和網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)等脈管樣改變。見圖1。

圖1 缺氧對(duì)Matrigel三維培養(yǎng)6 d OVCAR-3細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

2.2缺氧條件下OVCAR-3細(xì)胞LSD1的表達(dá)及酶活性檢測(cè) 取常氧和缺氧條件下培養(yǎng)7 d的OVCAR-3細(xì)胞，用Western印跡檢測(cè)LSD1及H3K4的水平(圖2)。缺氧條件刺激下，LSD1的表達(dá)有明顯的升高(2.91±0.2)(P=0.000)。為了說明LSD1的主要酶活性的升高，同時(shí)檢測(cè)H3K4(2m)的水平，實(shí)驗(yàn)證明H3K4的相對(duì)水平隨著LSD1升高而降低(0.22±0.03)(P=0.017)，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 缺氧對(duì)OVCAR-3細(xì)胞LSD1表達(dá)和H3K4(2)水平的影響

2.3缺氧條件下OVCAR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài) 倒置顯微鏡下，對(duì)照組和缺氧組的SOVAR-3 細(xì)胞均呈現(xiàn)，貼壁良好、形態(tài)梭形、胞核橢圓、胞漿透亮的狀態(tài)(圖3)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，MTT 法測(cè)定SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用，計(jì)算細(xì)胞抑制率，對(duì)照組和缺氧組分別是(1.32±0.01)，(1.34±0.01)(P=0.062)，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 缺氧對(duì)培養(yǎng)4 d OVCAR-3細(xì)胞角形態(tài)影響(×400)

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞從原發(fā)性部位轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端部位形成腫瘤的過程，它是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和影響預(yù)后的重要因素。多數(shù)癌癥都有侵襲轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。而浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是也是晚期食管癌重要死因。1999年，VM在在具有高度侵襲型的葡萄膜黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)〔1〕。VM獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)類似與胚胎的血管網(wǎng)絡(luò)。而兩者結(jié)構(gòu)的相似性被認(rèn)為是具有高度浸潤(rùn)性的腫瘤細(xì)胞具有類似與胚胎樣表型的分化潛能。基因表達(dá)研究揭示具有分化為VM的能力的高度侵襲性的黑色素瘤的基因表達(dá)與包括上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞特性在內(nèi)的多細(xì)胞表型有關(guān)〔2，3〕。

VM形成的“原動(dòng)力”腫瘤細(xì)胞的缺氧狀態(tài)。在缺氧狀態(tài)下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它在血管形成、細(xì)胞增殖、能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞黏附等相關(guān)基因的調(diào)控方面均占很重要的地位。在某些腫瘤(卵巢癌、宮頸癌等婦科實(shí)體瘤)發(fā)生過程中，缺氧是微環(huán)境的基本特征之一，作為一種應(yīng)激原可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)一系列基因?qū)Φ脱鯛顟B(tài)做出應(yīng)答反應(yīng)，并通過多條途徑使缺氧相關(guān)因子的表達(dá)增多。有研究顯示VM可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、EphA2等血管生成基因表達(dá)上調(diào)〔4，5〕。這些分子及其配體對(duì)血管的生成和維持極其重要〔6〕。VM形成后可以使腫瘤細(xì)胞獲得供氧，最終導(dǎo)致血液循環(huán)〔1，7〕。

參與可塑性腫瘤細(xì)胞形成VM的各種分子，而并不依賴某一條分子信號(hào)通路，這可以解釋為什么不同的腫瘤細(xì)胞在形成擬態(tài)血管時(shí)表達(dá)不同的VM相關(guān)基因，一些基因的“開或關(guān)”受表遺傳修飾控制。自從Strahl 和Allis提出“組蛋白密碼”假說后，組蛋白修飾逐漸成為表遺傳領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。2004年，第一個(gè)組蛋白賴氨酸去甲基化酶LSD1被發(fā)現(xiàn)〔8〕。LSD1發(fā)揮著重要的生理功能并與很多疾病有密切的關(guān)系〔9，10〕。在很多腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)過程中，LSD1表現(xiàn)出“原癌基因”的特性。令人感興趣的是：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LSD1分子在缺氧條件下表達(dá)上升，SKOV-3細(xì)胞的增殖能力缺未受影響。這也提示LSD1分子并不促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。

Wang等〔11〕的研究曾發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，研究LSD1可以形成NuRD復(fù)合物的一個(gè)亞單位，控制乳腺癌細(xì)胞遷移能力。在此過程中，LSD1行使H3K4(2m)去甲基化酶活性，啟動(dòng)了下游基因的開啟。但是目前尚未見LSD1對(duì)于相關(guān)腫瘤形成VM能力的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)說明缺氧促進(jìn)擬態(tài)血管的形成的同時(shí)也伴隨著LSD1的表達(dá)上升和H3K4(2m)去甲基化酶活性的提高。結(jié)果提示LSD1參與卵巢癌細(xì)胞VM的形成。不過，缺氧條件下卵巢癌細(xì)胞LSD1對(duì)于VM形成的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

4 參考文獻(xiàn)

1Einhorn N，Trope C，Ridderheim M.A systematic overview of radiation therapy effects in ovarian cancer〔J〕.Acta Oncol,2003；42(5-6):562-6.

2Perkins GL.Serum tumor markers〔J〕.Am Fam Physic，2003;68(6):1075-82.

3Cole LA，Schwartz PE,Wong Y.Urinary gonadotropin fragments(UGF) in cancers of the female reproductive system：I.Sensitivity and specificity，comparison with other markers〔J〕.Gynecol Oncol,1988;31:82-90.

4Alfthan H，Haglund C，Roberts P，etal.Elevation of free beta subunit of human choriogonadotropin and core beta fragment of human choriogonadotropin in the serum and urine of patients with malignant pancreatic and biliary disease〔J〕.Cancer Res,1992;52:4628-33.

5Marcillac I，Cottu P，Theodore C，etal.Free hCG beta subunit as tumour marker in urothelial cancer〔J〕.Lancet，1993;341:1354-5.

6Regelson W.Have we found the “definitive cancer biomarker”? The diagnostic and therapeutic implications of human chorionic gonadotropin-beta statement as a key to malignancy〔J〕.Cancer，1995;76:1299-301.

7La Vecchia C，Brinton LA，Mc Tiernan A.Cancer risk in menopausal women〔J〕.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2002；16(3):293-307.

8Mulligan JR，Whetstine，Shi Y，etal.Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1〔J〕.Cell,2004；119(7):941-53.

9Wang J，Scully K，Zhu X,etal.Opposing LSD1 complexes function in developmental gene activation and repression programmes〔J〕.Nature，2007；446(7138):882-7.

10Metzger E，Wissmann M，Yin N,etal.LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen receptor-dependent transcription〔J〕.Nature，2005；437(7057):436-9.

11Wang J，Scully K，Zhu X，etal.Opposing LSD1 complexes function in developmental gene activation and repression programmes〔J〕.Nature,2007；446(138):882-7.