腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力和海馬組織CREB、C/EBP的DNA結合活性改變

張泓波 高維娟 錢 濤 唐敬龍 李 君

(承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

腦缺血再灌(I/R)注既可挽救瀕死的細胞，又可加重缺血細胞的損傷，引起腦缺血再灌注損傷〔1〕而導致癡呆。學習和記憶中樞位于海馬，CA1區是腦缺血再灌注損傷的敏感區域。環磷酸腺苷反應(cAMP)元件結合蛋白(CREB)是細胞核內多種信號轉導通路的關鍵調節子，可調控多種基因的表達，具有調節包括學習在內的廣泛的生物學功能〔2〕。本研究通過觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后學習記憶能力、海馬CA1區神經元的改變和海馬組織CREB 及其效應蛋白CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)的DNA結合活性變化，探討腦缺血再灌注致血管性癡呆(VD)學習記憶障礙的發生機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年SPF級SD雄性大鼠48只，體質量(200±20)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號：SCXK(京)2007-0001〕。CREB及C/EBP寡聚核苷酸探針(上海英俊生物工程有限公司)；核蛋白抽提試劑盒(美國Pierce公司)；EMSA試劑盒(德國Roche公司)；帶正電荷的尼龍膜(美國Pall公司)；戊巴比妥鈉(德國)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模 用水迷宮將大鼠進行定位航行實驗和空間探索實驗，根據Nature Protocols推薦的標準〔3〕篩選出4只空間學習和記憶水平較差的大鼠后按體質量差異隨機數字表法分為假手術組和腦缺血再灌注損傷模型組，每組22只。模型組：戊巴比妥鈉(50 mg/kg)行腹腔麻醉后采用四血管阻斷(4-VO )方法〔4〕制備I/R大鼠模型。將大鼠行背側頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞。24 h后將大鼠麻醉，行腹側頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈5 min，共3次，每次間隔1 h。假手術組：只做皮膚切口和組織分離處理，不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。各組飼養30 d。

1.2.2水迷宮檢測學習記憶能力 第25～30天，對大鼠進行水迷宮試驗。去除手術死亡者，各組大鼠20只為最終統計對象。以手術后第29天大鼠逃避潛伏期(將大鼠從入水點面向池壁置入水槽中，記錄90 s內大鼠從入水到爬上平臺所需的時間)的平均成績作為學習成績；術后第30天大鼠空間探索次數(撤去平臺，將大鼠從第二象限入水點放入水槽，記錄60 s內其經過平臺象限的次數)的平均成績作為記憶成績。逃避潛伏期越短、跨越臺次數越多，學習記憶能力越強。

1.2.3HE染色觀察神經元形態改變 每組大鼠中隨機選取6只，1 g/L戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織。石蠟包埋，冠狀切片，制成4 μm厚連續切片HE 染色,光鏡下觀察海馬CA1區神經元形態學改變。切片采用MiVnt圖像分析系統進行定量分析：在10×40倍顯微鏡下，每張切片選6個不同子午線方向視野行各層細胞計數，取平均值。

1.2.4電泳遷移率改變分析法(EMSA)測定CREB和C/EBP的DNA結合活性 將各組大鼠迅速斷頭處死，在低溫修塊臺上分離出雙側海馬組織。稱重剪碎，勻漿棄上清。按核蛋白提取試劑盒提供的操作規程提取核蛋白。用BCA法進行蛋白定量后-80℃保存。設計CREB DNA結合序列 ：5′-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGAGCTAG-3′；C/EBP DNA結合序列5′-GATCAAGCTGCAGATTGCGCAAT -3′。探針標記參照DIG Gel Shift Kit操作手冊進行。標記反應結束后調整探針濃度為15.5 pmol/L。取各樣本核蛋白4 μg與標記的寡核苷酸探針2 μl 25℃孵育15 min。采用6%非變性聚丙烯酰凝膠4℃ 80V電泳分離DNA-核蛋白結合體。電泳完畢將DNA-核蛋白結合體轉移到帶正電荷的尼龍膜，化學發光法檢測特異性條帶。經曝光、顯影和定影后將圖像掃描至電腦，用Quantity one4.4凝膠分析軟件對特異結合條帶凈灰度值進行采集。凈灰度值代表轉錄因子與特定DNA的結合強度和活性。

2 結 果

2.1各組大鼠學習記憶能力的比較 與假手術組比較，模型組逃逸潛伏期明顯延長〔(41.3±1.8) vs (23.41±1.1)s,P<0.05〕，跨越平臺次數明顯減少〔(5.3±0.6)vs(8.0±1.0)次，P<0.05〕。

2.2各組大鼠海馬CA1區神經元形態和數目的改變 假手術組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊、均勻，細胞結構完整；模型組大鼠海馬CA1區部分神經元正常結構消失，胞核區域濃染，出現凝固性壞死及細胞脫失，正常神經細胞數目(16.33±1.08)較假手術組明顯減少(48.56±3.23，P<0.05)。見圖1。

2.3各組大鼠海馬組織CREB的DNA結合活性變化 經EMSA檢測,各組大鼠海馬組織核提取物均有與預先設計的CREB DNA序列的結合：與假手術組比較(612.50±43.56)，模型組大鼠海馬組織CREB的DNA結合活性顯著降低(142.25±27.86，P<0.01)。見圖2。

圖1 各組海馬CA1區神經元形態(HE，×400)

圖2 大鼠海馬CREB的DNA結合活性比較

2.4各組大鼠海馬組織C/EBP DNA結合活性的影響 經EMSA檢測，各組大鼠海馬組織核提取物均有與預先設計的C/EBP DNA序列的結合：與假手術組(1 218±37.15)比較，模型組大鼠海馬組織C/EBP的DNA結合活性顯著降低(97.00±5.88，P<0.01)。見圖3。

圖3 大鼠海馬C/EBP的DNA結合活性比較

3 討 論

VD的病理生理學機制包含多個快速的級聯反應，如免疫炎癥反應、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內鈣失穩態等，這些環節互為因果形成惡性循環最終導致細胞凋亡或壞死〔5〕，其功能表現之一為認知功能下降。核轉錄因子CREB磷酸化后可結合于基因啟動子上游cAMP反應單元(cAMP response element,CRE)的DNA結合序列，提高下游基因如即早基因(IEGs)c-fos、c-jun、c/reb等的表達。目前CREB已被確定為影響記憶存儲的關鍵蛋白〔6〕，可調節長時程增強(LTP)和突觸可塑性相關的基因轉錄。本實驗證實VD大鼠空間學習記憶障礙可能與海馬區CREB -DNA結合活性下降相關。此外，CREB對腦缺血再灌注損傷可發揮保護作用。例如鹽酸美金剛(NMDA受體的拮抗劑)，堿性成纖維細胞生長因子均可以通過不同途徑活化CREB從而減少缺血再灌注損傷后神經元凋亡〔7，8〕。CREB可增強抗凋亡蛋白Bcl-2、神經營養因子BNDF等的表達,參與缺血損傷后神經元的再生、存活及修復過程〔9，10〕。模型組神經元損傷可能與谷氨酸NMDA受體興奮毒性、鈣超載引起的神經毒性減少了CREB與DNA結合相關〔11，12〕。

本實驗發現模型組學習記憶功能下降的同時還出現了C/EBP-DNA結合活性的下降。C/EBP是IEGs的產物，它進一步激活晚期反應基因的表達，編碼長期調節突觸功能所必需的蛋白質。C/EBPβ在新記憶的永久化過程中具有促進作用〔13〕。關于c/EBPs在腦缺血再灌注損傷中的作用還有待進一步探討。有研究表明，C/EBPβ可介導缺血后的大腦免疫反應和神經元損傷〔14〕。最近研究發現，作為內質網應激的標志，C/EBP同源蛋白(CHOP)在大鼠局灶性腦缺血再灌注皮質和海馬中均可誘導表達，在缺血再灌注所致的神經細胞凋亡中可能發揮重要作用〔15，16〕。在慢性腦低灌注狀態下，C/EBP-DNA結合活性與大鼠海馬CA1區神經元損傷的關系尚未見報道。本研究發現在缺血再灌注損傷30 d后，模型組大鼠海馬C/EBP活性相對于假手術組下降，機制可能為CREB-DNA結合活性的下降影

響了C/EBP的表達，從而降低了后者的活性。但其靶基因為何，是否和短暫的腦缺血再灌注中發揮的作用相似，c/EBPs家族成員的功能是否一致，尚需進一步研究。本實驗C/EBP-DNA結合活性與神經元損傷變化趨勢相反，可能是缺血再灌注的早期反應基因調節參與了神經細胞的存亡，晚期調節反應基因與組織修復和功能恢復有關。

4 參考文獻

1Taoufik E,Probert L.Ischemic neuronal damage〔J〕.Curr Pharm Des,2008；14(33)：3565-73.

2Lonze BE,Ginty DD.Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system〔J〕.Neuron,2002；35(4):605-23.

3Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory〔J〕.Nature Protocols,2006；1(2):848-58.

4張 華,任朝勝.大鼠四血管腦缺血模型建立方法的改進〔J〕.鄭州大學學報(醫學版),2005；40(1):115-6.

5王海英,張秋玲,李金國,等.電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦細胞凋亡及神經功能恢復的影響〔J〕.中華行為醫學與腦科學,2010；19(6):510-2.

6Han JH,Kushner SA,Yiu AP,etal.Neuronal competition and selection during memory formation〔J〕.Science,2007；316(5823):457-60.

7任永富,劉合玉.鹽酸美金剛對血管性癡呆大鼠海馬神經元保護作用的研究〔J〕.中華行為醫學與腦科學,2009；18(2):131-3.

8曾朝陶，郭 和，邢雪松,等.bFGF對局部腦缺血再灌注大鼠海馬及皮質神經元CREB表達的影響〔J〕.第四軍醫大學學報,2009；30(6):517-9.

9Sakamoto K，Karelina K，Obrietan K,etal.CREB：a multifaceted regulator of neuronal plasticity and protection〔J〕.J Neurochem，2011;116(1):1-9.

10Lu Y,Zhang H,Ma Y.CREB and ischemia cererbral neuron damage〔J〕. Prog Sci，2010;16(4):374-6.

11Nadler JV.Aspartate release and signalling in the hippocampus〔J〕. Neurochem Res,2011；36(4):668-76.

12Luoma JI,Kelley BG,Mermelstein PG.Progesterone inhibition of voltage-gated calcium channels is a potential neuroprotective mechanism against excitotoxicity〔J〕.Steroids,2011；76(9):845-55.

13Alberini CM.Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity〔J〕.Physiol,2009；89(1):121-45.

14Choi BK,Kim JH,Jung JS,etal.Reduction of ischemia-induced cerebral injury by all-trans-retinoic acid〔J〕.Exp Brain Res,2009；193(4):581-9.

15申向民,楊期東,譚利明,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡分子C/EBP同源蛋白的表達變化〔J〕.中國動脈硬化雜志,2010；18(1):43-6.

16Osada N，Kosuge Y,Ishige K,etal.Characterization of neuronal and astroglial responses to ER stress in the hippocampal CA1 area in mice following transient forebrain ischemia〔J〕.Neurochem Int,2010；57(1):1-7.