刺五加皂苷對(duì)Aβ25～35誘發(fā)PC12細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

元紅花 程 琳 許妍姬

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

目前，阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確，至今仍缺少有效的治療方法，該領(lǐng)域已成為當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)〔1〕。刺五加系五加屬植物的干燥根及根莖，主要用于鎮(zhèn)靜、安神、健脾、補(bǔ)腎。刺五加皂苷具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗衰老、降血脂、降血糖、抗癌等藥理作用〔2〕。先前用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法研究了刺五加提取液對(duì)老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及腦組織生化學(xué)改變的保護(hù)作用。本文擬采取體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步探討刺五加皂苷對(duì)老年性癡呆的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞珠、藥品與試劑 PC12細(xì)胞珠由韓國(guó)首爾醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教室徐裕憲教授饋贈(zèng)。處理神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)使其分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。二甲基亞礬(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽由北京化工廠提供；Aβ25～35(Sigma)；NGF (Calbiochom) ；胎牛血清(Corning，N.Y，14831，USA) ；胰蛋白酶(碧云天生物科技有限公司)；青霉素、鏈霉素；DMEM培養(yǎng)液(Sigma)；刺五加皂苷購于上海源葉生物科技公司；活化的半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)單克隆抗體、二抗蛋白印跡(WB)封閉液、洗膜液、Annexin-V細(xì)胞凋亡試劑盒均購自碧云天生物有限公司。丙二醛(MDA)含量試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫水浴鍋、分析天平、CO2培養(yǎng)箱、低速容量離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、生物顯微鏡、722-分光光度計(jì)、蛋白印跡電泳裝置、制冰機(jī)、微量振蕩器、立式壓力蒸汽滅菌器、移液器等均由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。流式細(xì)胞儀(BD)由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組 將PC12細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天加入NGF，2～3 d后細(xì)胞分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分五組:①正常對(duì)照組：用DMSO溶液處理2 h，隨后加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液。②模型組：用DMSO溶液先處理2 h，之后用10 mol/L Aβ25～35。③刺五加皂苷低劑量組：用12.5 mg/L刺五加皂苷處理2 h，隨后用Aβ25～35處理，濃度為10 mol/L。④刺五加皂苷中劑量組：用25 mg/L的刺五加皂苷處理2 h，后用10 mol/L Aβ25～35處理。⑤刺五加皂苷高劑量組：先用50 mg/L的刺五加皂苷處理2 h，后用10 mol/L Aβ25～35處理。

1.4溶液配制 ①Aβ25～35溶液的配制，將Aβ25～35用無菌的PBS溶液配制成50 mol/L 母液，在4℃冰箱中保存。②噻唑藍(lán)(MTT)溶液的配制，將100 mg MTT用無菌PBS溶液配制成5 g/L的母液，0.22 μm濾膜過濾除菌，避光，4℃冰箱中保存。

1.5線粒體琥珀酸脫氫酶活性測(cè)定 用胰酶將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的PC12細(xì)胞進(jìn)行消化，置于96孔板中，100 μl/孔，6孔為1組，37℃培養(yǎng)箱中孵育，過夜，第2天更換培養(yǎng)液，每孔加100 μl培養(yǎng)液，再加100 μl MTT，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸出上清液，每孔加入DMSO溶液 100 μl，振蕩10 min左右，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，等顆粒完全溶解后吹打，混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)量吸光度值。

1.6乳酸脫氫酶(LDH)釋放量和MDA含量測(cè)定 藥物處理24 h后，取細(xì)胞上清液測(cè)量LDH釋放量，細(xì)胞用RIPA裂解液做細(xì)胞裂解之后，取細(xì)胞裂解液測(cè)量MDA含量，嚴(yán)格按照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7細(xì)胞凋亡測(cè)定(流式細(xì)胞術(shù)) 利用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行測(cè)定。把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，PBS洗滌細(xì)胞1次，用胰酶消化，加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取(1～5)×105重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl結(jié)合液重懸細(xì)胞，過300目尼龍網(wǎng)后，加入5 μl AneexinV-FITC，輕輕混勻，再加入5 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，隨即流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析。正?；罴?xì)胞不被AneexinV-FITC和PI染色，早期凋亡細(xì)胞僅被AneexinV-FITC染色，PI染色陰性；壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞可同時(shí)被AneexinV-FITC和PI染色。

1.8活化的Caspase-3蛋白水平測(cè)定 (Western印跡方法) 取出處理的細(xì)胞，用真空泵吸取上清，冰冷的滅菌PBS清洗細(xì)胞2～3次。每孔加一定量的細(xì)胞裂解液(PIRA∶PMSF=100∶1)，用細(xì)胞刮刮數(shù)次(此步驟在冰上操作)。收集液體，超聲波破碎數(shù)次，2～3 s/次。4℃，10 000 r/min，低溫離心機(jī)離心10 min，棄上清。用碧云天二喹啉(BCA)法蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得蛋白含量。蛋白定量，100℃加熱使蛋白變性，上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后進(jìn)行聚氟偏乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h，用活化的Caspase-3單克隆一抗4℃搖床孵育過夜，洗滌液洗3次，用辣根過氧化物酶抗兔(1∶1 000)在搖床上室溫孵育1 h，洗滌液洗3次。采用化學(xué)發(fā)光法顯色成像。

2 結(jié) 果

2.1線粒體琥珀酸脫氫酶活性測(cè)定 Aβ處理組與正常對(duì)照組比較，MTT代謝率顯著降低(P<0.01)，不同濃度刺五加皂苷保護(hù)組與Aβ處理組比較，MTT代謝率明顯升高，其中刺五加皂苷中劑量組和高劑量組差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2LDH釋放量測(cè)定 Aβ處理組與正常對(duì)照組比較，LDH釋放量顯著升高(P<0.01)，不同濃度刺五加皂苷保護(hù)組與模型組比較，LDH釋放量顯著降低，其中刺五加皂苷中劑量組和高劑量組差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.3MDA含量測(cè)定 Aβ處理組與正常對(duì)照組相比較，MDA含量顯著升高(P<0.01)，不同濃度刺五加皂苷處理組與Aβ組相比較，MDA含量降低，其中刺五加皂苷中劑量組和高劑量組有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

2.4流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡 Aβ處理組早期、晚期凋亡細(xì)胞與對(duì)照組比較顯著增高(P<0.01)，各刺五加皂苷組與Aβ25～35處理模型組比較凋亡率顯著減少(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 刺五加皂苷對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞毒性的影響

表2 刺五加皂苷對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞凋亡率的影響(%)

2.5活化的Caspase-3蛋白水平測(cè)定 用NGF處理的PC12細(xì)胞，Westem印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aβ處理組與正常對(duì)照組比較，活化的Caspase-3蛋白水平明顯增加(P<0.05)，不同濃度刺五加皂苷劑量組其蛋白水平均下降，與Aβ處理組比較差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組活化的Caspase-3蛋白水平檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

老年性癡呆患者病理典型變化是腦組織中老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。淀粉樣前體蛋白(APP)先后經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶的剪切之后，產(chǎn)生了Aβ和不同長(zhǎng)度的APP-C端游離片段。Aβ是老年斑的主要成分〔1〕。PC12細(xì)胞是來自大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株，用NGF誘導(dǎo)后可長(zhǎng)出突起，具有神經(jīng)細(xì)胞特性，且可傳代培養(yǎng)，類型較為單一，細(xì)胞特性穩(wěn)定，用Aβ25-35直接誘導(dǎo)PC12凋亡可建立具有代表性的AD模型，實(shí)驗(yàn)條件易于控制，是體外進(jìn)行AD研究的理想模型〔3，4〕。

MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞生存和增殖活性的方法，此方法由Mosmann在1983年首次提出，它的原理是活細(xì)胞內(nèi)的線粒體琥珀酸脫氫酶可以使MTT還原成藍(lán)紫色的甲臢，其吸光度與活細(xì)胞數(shù)呈正比，通常線粒體琥珀酸脫氫酶幾乎很少從神經(jīng)細(xì)胞中釋放，當(dāng)受損神經(jīng)元細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變時(shí)，隨后會(huì)出現(xiàn)大量線粒體琥珀酸脫氫酶從細(xì)胞釋放，其累計(jì)釋放量與受損神經(jīng)元數(shù)量呈正比〔5～7〕。本實(shí)驗(yàn)中用Aβ25～35處理PC12細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的損傷，與文獻(xiàn)〔8，9〕報(bào)道相符，不同劑量的刺五加皂苷起到了保護(hù)受損細(xì)胞的作用。用MTT法檢測(cè)處理后細(xì)胞的損傷度，從而了解不同劑量的刺五加皂苷的保護(hù)程度。

Caspase-3全稱為天冬氨酸特異性酶切半胱氨酸蛋白酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的一類關(guān)鍵蛋白酶，也是凋亡的執(zhí)行者，在AD的病理過程中Caspase-3起著凋亡效應(yīng)器的重要角色，使它成為研究AD的新靶點(diǎn)〔10，11〕。本研究結(jié)果表明刺五加皂苷可抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

刺五加皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞毒性和凋亡的保護(hù)作用的保護(hù)機(jī)制可能是抗氧化機(jī)理。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)刺五加提取液對(duì)老年性癡呆模型小鼠的保護(hù)作用〔12，13〕，其中抗氧化機(jī)制也是刺五加對(duì)老年性癡呆保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。刺五加皂苷對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞毒性和凋亡的保護(hù)作用還需要進(jìn)一步探討。

4 參考文獻(xiàn)

1肖增平，吉愛國(guó).老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制及治療的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008；28(1)：95-7.

2張 祎，劉寶珠，裴月湖.刺五加藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002；19(2)：143-6.

3Kolla N，Wei Z，Richardson S，etal.Amitriptyline and fluoxetine protect PC12 cells from cell death induced by hydrogen proxide〔J〕.Psychiatry Neurosci，2005；30(3)：196-201.

4房紹寬，吳 江，周春奎.萬拉法辛對(duì)Aβ25-35誘發(fā)PC12細(xì)胞損傷及Bcl-2表達(dá)下降作用的研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008；28(18)：1799-801.

5林 董，何愛明，吳麗萍，等.MTT法測(cè)定8種中草藥體外抗肝癌細(xì)胞SMMC-7721活性〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009；37(34)：17264-6.

6楊翠云，劉永定.MTT方法評(píng)價(jià)微生物細(xì)胞活性的探討〔J〕.水生生物學(xué)報(bào)，2009；33(4)：577-80.

7Wang JZ，Wang ZF.Role of melatonin in Alzheimer-like neurodefeneration〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2006；27(1)：41-9.

8羅 蔓，謝瑞滿.β-淀粉樣蛋白25-35 片段誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡〔J〕.復(fù)旦大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2004；31(6)：618-21.

9Hosoda T，Nakajima H，Honjo H.Estrogen protects neuronal cells from amyloid β-induced apoptotic cell death〔J〕.Neuroreport，2001；12(9)：1965-70.

10郭艷芹，安麗榮，關(guān)亞新 .α-FGF 對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008；28(3)：244-6.

11張亞輝，李 佳，周忠良.Caspase-3：治療神經(jīng)退行性疾病的新靶點(diǎn)〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2003；30(2)：175-9.

12Yanji XU.Effects of acanthopanax senticosus on learning and memory in a mouse model of Alzheimer’s disease and protection against free radical injury to brain tissue〔J〕.Neural Regeneration Research，2008；3(2)：192-5.

13許妍姬.刺五加對(duì)癡呆模型小鼠記憶障礙及MDA含量、SOD和乙酰膽堿脂酶活性的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010；9(30)：1238-40.