養壽丹對 AD大鼠學習記憶能力及NGF、TrkA蛋白表達的影響

興桂華 吳淑琴 官 杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

老年性癡呆病亦稱阿爾茨海默病(AD)，是發生于老年期或老年前期的中樞神經系統退行性疾病，臨床以進行性記憶和后天獲得的知識喪失，直到最后喪失生活能力為特征。神經生長因子(NGF)是一種最早被發現、研究最為透徹的神經肽類物質，具有營養和保護膽堿能神經的作用。研究〔1〕表明，NGF缺乏是AD發生的機制之一。因此，探索NGF表達機制對于AD等神經退行性疾病的治療具有重要意義。NGF可通過高親和力酪氨酸激酶A(TrkA)受體介導以發揮其生物學作用。研究發現，AD早期即可現皮質神經元TrkA受體的表達下降〔2〕，改善TrkA受體的治療可能會減慢膽堿能神經元退化速度〔3〕。本實驗采用腦基底核內立體定向聯合注射β-淀粉樣蛋白酶(Aβ1～40)和興奮性氨基酸建立AD動物模型，以養壽丹進行藥物干預，觀察養壽丹對大鼠學習記憶能力和海馬組織NGF、TrkA蛋白表達的影響，旨在探討養壽丹改善AD大鼠學習記憶功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠100只，鼠齡8～12 w，體重(280±20)g，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證編號SCXK(吉)2011-0004。

1.1.2藥物與主要試劑 養壽丹組成：何首烏、熟地、巴戟、枸杞子、川斷、牛膝、肉蓯蓉、茯苓、菟絲子、白術、遠志、石菖蒲，上述藥材均購自安國市弘發中藥材飲片有限公司，處方中各味藥比例為3∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1∶1〔4〕。加水煎煮2次，第1次3 h，第2次2 h，合并煎液，濾過，濃縮液含生藥5.6 g/ml， 貼標簽后將藥液貯存于4℃保存備用。Aβ1～40為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。鹽酸多奈哌齊片由衛材(中國)藥業有限公司制造，產品批號110917A。鵝膏蕈氨酸(IBO,Sigma公司)，均為分析純。Rabbit Anti-NGF、Rabbit Anti-TrkA抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，SP即用型試劑盒及二氨荃聯苯胺(DAB)顯色劑均購于福州生物技術公司。

1.1.3主要儀器 Morris水迷宮系統(中國醫學科學院藥物研究所)，江灣Ⅰ型C立體定向器(第二軍醫大學)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及模型建立 大鼠經適應性飼養1 w，隨機分為空白對照組、假手術對照組、模型組、鹽酸多奈哌齊對照組(西藥對照組)和養壽丹組，每組20只。造模〔5〕：將實驗大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉后，常規備皮消毒，沿顱頂中線切開頭皮，切口約2 cm，分離骨膜暴露頭骨，以前囟門為基點，由前囟向后0.5 mm，再從正中向右移至2.8 mm處，用牙科鉆打開顱骨，垂直插入微量注射器,使針尖自腦表面進針7 mm至Myenert核，將1 μl溶液(內含Aβ1～404 μg和IBO 1 μg，溶于生理鹽水)混合液緩慢注入，20 min內分4次注射完畢，留針5 min，縫合皮膚。模型組、鹽酸多萘哌齊組、養壽丹組分別注射1 μl Aβ1～40和Iboteni cacid的混合液。用同樣方法假手術組注射生理鹽水1 μl。

1.2.2給藥方法 造模后第3天開始給予藥物干預，根據人和動物按體表面積折算的等效劑量。空白對照組、假手術對照組、模型組均按0.5 ml/100 g體重給予生理鹽水灌胃，1次/d，鹽酸多奈哌齊對照組按0.33 mg·kg-1·d-1，養壽丹組(含5.6 g生藥/ml)給藥，灌胃方法同模型組，連續2個月。

1.2.3Morris水迷宮試驗 給藥結束后進行Morris水迷宮行為測試。水迷宮為一不銹鋼圓形水池，直徑150 cm，高60 cm，內置有機玻璃平臺，平臺高40 cm，底面為6 cm×10 cm。在水池壁東、西、南、北部位分別標明入水點。將平臺放在西南象限正中距池壁22 cm處，迷宮中含牛奶液面高于安全平臺1 cm，水溫(22±1)℃，加適量奶粉使水呈乳白色，訓練期間環境安靜，迷宮外參照物不變。

Morris水迷宮實驗前5 d為定位航行試驗，用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。每天從東入水點頭朝池壁將大鼠放入水池，第1天讓大鼠自由游泳2 min；從第2天起，每天分上、下午兩段，每段訓練4次。訓練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間(即潛伏期)，每次訓練間隔60 s。自動攝像系統記錄大鼠尋找平臺的時間(逃避潛伏期)，設定2 min為最長逃避潛伏期，2 min后自動停止記錄。如果大鼠在2 min未找到平臺，則由實驗者用手牽引其到平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中，記錄時間為2 min。實驗第6天為空間探索試驗。定位航行試驗結束后撤除平臺，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺，記錄在2 min內跨過原平臺位置的次數。

1.2.4免疫組化檢測NGF 、TrkA蛋白表達 行為學測試完成后，每組隨機選6只大鼠斷頭處死，快速取出腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，厚約4 μm。采用SP法進行免疫組化染色，主要步驟：切片常規脫蠟至水，3% H2O2室溫25 min滅活內源性過氧化物酶，微波爐加熱進行抗原修復。用5%胎牛血清(BSA)封閉液室溫封閉20 min，滴加Rabbit Anti NGF (稀釋度1∶100)、Rabbit Anti-TrkA(稀釋度1∶100)，4℃冰箱過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 20 min，滴加鏈酶卵蛋白37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，以上各步驟均用0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，5 min/次。顯色后常規脫水、透明、封片，光鏡下觀察，棕黃色著色處為陽性。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統對大腦海馬NGF、TrkA陽性細胞進行測量分析每個統計場的積分光密度，每組6例大鼠，每張切片觀察5個視野。

2 結 果

2.1養壽丹對大鼠定位航行試驗逃避潛伏期的影響 在5 d的定位航行試驗中，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體上呈現下降趨勢，而模型組大鼠平均潛伏期下降速度相對較慢，與假手術組比較，模型組大鼠在第2、3、4、5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；養壽丹組和鹽酸多奈哌齊對照組大鼠平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)。見表1。

2.2養壽丹對大鼠空間探索跨越原平臺次數的影響 第6天的空間探索試驗結果顯示：模型組大鼠跨越原平臺次數〔(1.70±1.30)次〕較空白對照組〔(15.35±1.39)次〕明顯減少(P<0.05)，與模型組比較，養壽丹組〔(4.00±1.65)次〕和鹽酸多奈哌齊對照組〔(5.05±1.73)次〕大鼠跨越原平臺次數明顯增加(P<0.05)。假手術對照組為(5.85±1.42)次。

表1 養壽丹對大鼠定位航行試驗逃避潛伏期的影響

2.3養壽丹對各組大鼠海馬區NGF、TrkA表達的影響 光鏡下觀察NGF蛋白免疫組化反應物質為棕黃色，呈胞質著色。TrkA蛋白陽性反應物質呈棕黃色，胞漿質核均有著色。與假手術對照組比較,模型組海馬區NGF、TrkA積分光密度降低(P<0.05)；與模型組相比，假手術對照組、鹽酸多奈哌齊對照組及養壽丹組海馬區NGF、TrkA積分光密度增高(P<0.05)。見表2，圖1，圖2。

表2 養壽丹對各組大鼠海馬區TrkA、NGF表達的影響

圖1 各組大鼠海馬區NGT表達(×200)

3 討 論

學習記憶障礙是AD主要臨床癥狀和特征，因此，對學習記憶進行評價是觀察AD模型及藥物治療效果的重要指標之一〔6〕。經典、較為穩定的學習記憶檢測方法包括迷宮法、跳臺法、避暗法、穿梭法等，在一定程度上反映動物對空間位置的學習記憶能力。Morris水迷宮實驗是一種讓實驗動物學習尋找不透明水中隱藏平臺的操作過程，是國內外公認的檢測大鼠空間學習記憶理想而有效的測試方法〔7〕，已被廣泛用于研究AD海馬記憶損傷的效果和藥物療效的評價〔8〕。本研究結果表明養壽丹對模型大鼠的學習障礙具有改善作用，提高AD大鼠的學習記憶功能。

NGF是一種由118個氨基酸組成的蛋白質，為最早被發現、研究最為透徹的神經營養因子，也是維持神經系統功能重要的生物活性分子之一。NGF選擇性作用于大腦皮質、海馬區的膽堿能神經元，促進膽堿能神經元的分化、生長和發育,可促進神經元損傷后的修復與再生，促進異常神經細胞凋亡〔9〕。研究發現，NGF缺乏是AD發生的機制之一，認為NGF的異常表達及信號轉導系統的障礙或NGF轉運系統受阻參與了AD病理生理過程。NGF在海馬和大腦皮質合成后，通過與其特異性TrkA受體結合，并逆行運輸到基底前腦膽堿能神經元后發揮其生物學效應。TrkA受體是由原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體，是神經元細胞膜上 NGF 的高親和力受體。研究〔2〕發現，AD的早期階段即出現皮質神經元TrkA受體的表達下降,改善TrkA受體的治療可能會減慢膽堿能神經元退化速度〔3〕。

本實驗結果提示聯合注射Aβ1～40和興奮性氨基酸可造成大鼠神經元的功能受損，神經信號傳遞發生障礙。由于NGF水平不足可直接影響神經元信號轉導通路的中心環節，造成神經元功能受損，最終導致AD的發生〔10〕。TrkA受體缺乏可引起NGF依賴性細胞信號轉導障礙，造成神經營養支持的缺乏，在某種程度上促使了膽堿能神經元的退變,從而引發AD的相關癥狀。養壽丹組NGF、TrkA蛋白表達均較模型組增高，提示養壽丹能夠增加海馬區NGF、TrkA蛋白表達，對膽堿能神經元起到保護和修復作用，進而改善AD模型大鼠的學習記憶功能。

4 參考文獻

1王 蓉，盛樹力.老年性癡呆及相關疾病〔M〕.北京:科學技術文獻出版社,2006:283-8.

2Counts SE，Nadeem M，Wuu J，etal.Reduction of cortical TrkA but not P75(NTR) protein in early-stage Alzheimers disease〔J〕 .Ann Neurol，2004;56(4):520-31.

3Ginsberg SD,Che S,Wuu J,etal.Down regulation of trk but not 75NTR gene expression in single cholinergic basal forebrain neurons mark the progression of Alzheimer’s disease〔J〕.Neurochemistry，2006;97(2):475-87

4黃兆勝,劉明平,孫 維，等.養壽丹對阿爾茨海默病腎陽虛大鼠腦神經遞質的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2002;8(1):26-8.

5陳 勤,胡雅兒,夏宗勤.知母皂甙元對腦內注射β- 淀粉樣肽癡呆模型大鼠的影響〔J〕.上海第二醫科大學學報，2001;21(5):401-3.

6Jankowsky JL,Melnikova T,Fadale OT，etal.Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.J Neurosci,2005;25(21):5217-24.

7Spowart-Manning L,vander Staay FJ.Spatial discrimination deficits by excitotoxic lesions in the Morris water escape task 〔J〕.Behav Brain Res,2005;56(2):269-76.

8Hu ZH,Wang XC,Li LY,etal.Correlation of behavior changes and bold signal in alzheimer-like rat model〔J〕.Acta Biochimi Biophysi Sini,2004;36(12):803-10.

9Pehar M,Cassina P,Vargas MR.Modulation of P75-dependent motor neuron death by a small non-peptidyl mimetic of the neurotrophin loop 1 domain〔J〕.Eur J Neurosci，2006;24(6):1575-80.

10Frielingsdorf H,Simpson DR,Thal LJ,etal.Nerve gowth factor promotes survival of new neurons in the adult hippocampus〔J〕.Neurobiol Dis，2007;26(1):47-55.