羅布麻提取物對ox-LDL誘導U937形成泡沫細胞過程中TNF-α表達的影響

巨名飛 王智昊 賈立立 黃賢勝 王瑞鵑 張愛文 鄭 楊

(承德醫學院附屬醫院心臟科，河北 承德 067000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應伴隨其發展始終〔1〕。炎癥因子和炎細胞間相互作用是AS發病機制的核心。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是致AS的獨立危險因素，它廣泛參與了致血管內皮細胞損傷、促使泡沫細胞形成、促進血小板聚集等關鍵環節，構成AS病變的起始階段〔2〕，同時其還發揮類似于前炎癥介質的作用，誘導AS中的炎細胞表達和分泌炎癥因子，級聯放大炎癥反應。研究顯示它可以誘導內皮細胞表達腫瘤壞死因子(TNF-α)，加速AS的進程〔3,4〕。羅布麻(AV)具有降壓、降脂、延緩衰老等功效。近年研究發現AV對AS也有一定的防治作用。本實驗以ox-LDL誘導的U937細胞形成的泡沫細胞為AS實驗模型，觀察AV對ox-LDL誘導U937細胞形成泡沫細胞過程中TNF-α表達的影響，旨在說明AV通過抑制炎癥因子發揮抗AS作用。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑 AV提取物購自西安奧晶科技發展有限公司。佛波酯購自Sigma公司。人TNF-α定量酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。RPMI- 1640培養基和Trizol購自Gibco公司。M-MLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP、Oligo(dT)購自Promega公司。引物由上海生工合成。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2LDL的純化、氧化修飾及鑒定 采集健康成人空腹12 h后新鮮混合靜脈血，加入100 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用超速離心法42 000 r/m離心獲得LDL提取液，經瓊脂糖電泳顯示為單一蛋白帶。將LDL置于含10 μmol/ L CuSO4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液(pH 7.4)中，37℃溫育24 h。氧化后的LDL置含200 μmol EDTA的PBS中透析24 h，PBS再透析24 h，過濾除菌后4℃保存。LDL中的脂過氧化物在氧化過程中增加，顏色也逐漸變淺。瓊脂糖電泳顯示，ox-LDL 的電泳遷移速率快于未氧化的LDL。

1.3U937細胞培養及誘導分化 人U937單核細胞株由吉林大學基礎免疫教研室饋贈。細胞懸浮樣生長于含10%高溫滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。每2～3天換液1次。

1.4實驗分組 每次實驗前用100 nmol/L佛波酯(PMA)孵育U937單核細胞72 h，使其誘導分化為巨噬細胞，換無血清24孔培養板培養24 h后加處理因素。將細胞隨機分為五組，對照組：U937巨噬細胞置于無血清24孔培養板培養中。模型組(ox-LDL)：在U937巨噬細胞的培養液中加入ox-LDL 100 mg/L〔3,4〕，AV低濃度組(AV1)：在培養的細胞中加入AV提取物(0.2 mg/L)，然后加入ox-LDL 100 mg/L。AV中濃度組(AV2)：在培養的細胞中加入AV提取物的濃度為0.4 mg/L。AV高濃度組(AV3)：在培養的細胞中加入AV提取物的濃度為0.8 mg/L。各組設3個復孔，于5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養24 h。

1.5ELISA檢測TNF-α蛋白的表達 收集各組細胞上清液；建立標準曲線：設標準孔(8孔)，每孔中各加樣品稀釋液100 μl，第1孔加標準品100 μl,混勻后用加樣器吸出100 μl，移至第2孔。如此反復作對倍稀釋至第7孔，最后，從第七孔中吸出100 μl棄去，使體積均為100 μl。第8孔為空白對照；加樣：待測品孔每孔各加入待測樣品100 μl；將反應板置加入37℃ 120 min；洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙尚印干；每孔中加入第一抗體工作液50 μl；將反應板充分混勻后置37℃ 60 min；洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙尚印干；每孔加酶標抗體工作液100 μl；將反應板充分混勻后置37℃ 60 min；洗板：同前；每孔加入底物工作液100 μl，置37℃暗處反應5～10 min；在492 nm處測吸光值，記錄結果。

1.6RT-PCR檢測TNF-α mRNA的表達 收集兩組細胞，TrIzol 試劑提取細胞總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計測定A260/A280 的比值在1.8～2.0 之間。分別取1 μg RNA 在20 μl反應體系中逆轉錄合成cDNA;取5 μl cDNA 于50 μl反應體系中進行PCR擴增TNF-α引物，上游:5′-ATGAGCAGAAAGATGATC-3′,下游：5′-TACAGGCTTGTCACGAATT-3′(298 bp)。內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，上游:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游：5′-TCCACCACCTGTTGCTGTA-3′(450 bp)。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴乙啶)3 V/cm電泳分離,對電泳條帶進行掃描定量分析并攝像,應用作為GAPDH內參照。TNF-α mRNA 表達分析:采用Image Master VDS進行光密度掃描(IOD) ,以TNF-α各組條帶和相應GAPDH條帶的IOD 比值表示TNF-α表達的強弱。

2 結 果

2.1U937單核細胞分化為巨噬細胞、泡沫細胞形態學改變 光學顯微鏡下U937細胞呈圓形、懸浮狀態，經100 nmol/L PMA誘導分化后,細胞形態變為梭形、橢圓形或不規則形，由懸浮變為貼壁狀態，且伸展偽足，細胞體積增大，表明已經分化為巨噬細胞。再與100 mg/L ox-LDL孵育后油紅O染色可見細胞內含許多紅色脂類顆粒物質，提示AS泡沫細胞模型制備成功。

2.2ELISA方法檢測TNF-α蛋白的表達結果 ox-LDL組〔(90.82±11.58)pg/ml〕較對照組〔(38.70±2.90)pg/ml〕TNF-α分泌量明顯增加，三組不同濃度的AV提取物〔(66.21±5.79)、(63.31±4.34)、(51.73±4.34)pg/ml〕與ox-LDL組比較TNF-α 含量減少(P<0.05)。且隨AV濃度的增加TNF-α表達呈逐漸下降趨勢。

M:Marker, 1,6：對照組；2,7:ox-LDL組；3,8：AVI組：4，9：AV2組：5，10：AV3組

2.3RT-PCT檢測TNF-α基因 對照組中TNF-α條帶顏色較淺〔光密度比值(0.23±0.02)ratio〕，ox-LDL作用U937M 24 h后條帶顏色明顯加深〔(1.12±0.04)ratio〕；加用不同濃度的AV后，TNF-α條帶顏色比ox-LDL組變淺〔光密度比值分別為(0.83±0.03)、(0.56±0.04)、(0.44±0.04)ratio〕。ox-LDL組與C組比較TNF-α表達明顯增加(P<0.05)，這與ELISA結果基本一致。見圖1。

3 討 論

AS是現代社會嚴重威脅人類健康的疾病之一，但至今其發病機制仍未完全闡明，目前比較公認的發病機制是炎癥損傷學說即AS是一種炎癥性疾病，炎癥反應伴隨其發展始終。

ox-LDL是致AS的獨立危險因素，具有細胞毒性，可致內皮細胞損傷，引起內皮功能障礙，產生促AS發生的環境〔6〕；趨化單核細胞并誘導泡沫細胞形成；抑制巨噬細胞重新返回血液循環，促進巨噬細胞增殖；誘導平滑肌細胞增殖和凋亡；促進粥樣斑塊的破裂和血栓形成；誘導自身抗體與其形成循環免疫復合物，促進AS發生。此外，ox-LDL可作為炎癥過程中潛在的誘導劑，誘導AS中主要細胞表達一些炎性因子、趨化因子的表達〔7〕如單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1、白細胞介素(IL)-1等。由于生物連鎖反應，這些因子又可刺激炎細胞，形成正反饋級聯放大炎癥反應，加速AS的發展，導致心血管不良事件的發生。單核細胞是巨噬細胞的主要來源〔8〕。本實驗進一步證明ox-LDL趨化單核細胞并誘導泡沫細胞形成同時，還可發揮類似于前炎癥介質的作用，刺激炎癥因子的表達。這可能是其致AS形成的重要機制之一。

TNF-α是一種主要由巨噬細胞分泌的炎癥細胞因子，具有抗病毒、調節免疫和誘發炎癥反應等多種生物學功能。大量研究表明它是AS中重要的炎癥因子，參與AS發生、發展的過程，研究表明它可直接作用于血管內皮致內皮細胞損傷，啟動AS過程；它還可以促進血管內皮細胞表達黏附分子和其他炎癥介質，來促進白細胞、單核細胞等與血管內皮的黏附聚集，增強局部的炎癥反應； 趨化、活化單核細胞向內膜下遷移；促進血管內皮細胞釋放組織因子(TF)，啟動凝血過程；干擾脂質代謝和介導細胞凋亡；促進新血管和血栓形成，加速AS的發生發展〔9〕。

抗感染治療是AS新的研究方向，AV是主要分布于我國西北鹽堿和沙漠地區的多年生夾竹桃科植物，其蘊含多種有益于心血管疾病的活性成分如黃酮類、苷元、有機酸等〔5〕。有研究〔10〕表明，AV可抑制ox-LDL參與AS過程。本實驗結果提示AV對AS的預防和治療有一定作用，其抗AS作用機制可能是通過抑制AS中炎性因子的表達和分泌，減輕炎癥反應實現的。AV在AS中的具體作用途徑尚需進一步研究。

4 參考文獻

1Penn MS,Topol EJ.Tissue factor ,the emerging link between inflammation，thrombosis，and vascular〔J〕.Circ Res，2001;89(1):1-2.

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4Zhang YC,Wei JJ,Wang F,etal.Elevated levels of oxidized low-density lipoprptein correlate positively with C-reactive protein in patients with acute coronary syndrome〔J〕.Cell Biochem Biophys,2012;62(2):365-72.

5侯晉軍,韓利文,楊官娥,等.羅布麻葉化學成分和藥理活性研究進展 〔J〕.中草藥，2006；37(10):7-9.

6何玉萍，匡忠生，何玉珊，等.氧化低密度脂蛋白損傷血管內皮細胞及促進血管平滑肌細胞增殖的機制〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(4)：837-9.

7李厚軒，雷 浪，閆福華.氧化型低密度脂蛋白誘導泡沫細胞形成過程中細胞因子水平的變化〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2010;26(8)：742-5.

8Iwata H,Nagai R.Novel immeune signals and atherosclerosis〔J〕.Curr Atheroscler Rep,2012;14(5):484-90.

9Valginili M,Merli E,Malagutti P,etal.Hydroxyl radica generation ,levels of tumor necrosis factor-alpha,and progression to heart failure after acute myocardial infarction〔J〕.J Am Coll Cardiol,2004;43(11):2000-8.

10聶淑琴.羅布麻葉對低密度脂蛋白氧化的抑制作用〔J〕.國外醫學·中醫中藥分冊，2000;22(3)：166-7.