BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2在三陰乳腺癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響

馬 靜 魏素菊 王俊艷 劉 巍 劉風(fēng)鈴 姜 達(dá)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,河北 石家莊 063000)

三陰乳腺癌(TNBC)由于對(duì)內(nèi)分泌及曲妥珠單抗治療不敏感，故其預(yù)后較其他乳腺癌差，治療較為棘手。因此，加強(qiáng)TNBC分子水平研究，尋找對(duì)TNBC敏感、便捷、具有預(yù)后影響意義的篩查指標(biāo)成了一個(gè)迫在眉睫的問題。本研究分別檢測(cè)了26例TNBC與非TNBC病理蠟塊中BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2的蛋白表達(dá)情況，探討它們與TNBC預(yù)后的關(guān)系,為TNBC的診治及預(yù)后判斷提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選取2005年及2006年于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的乳腺癌患者的病理蠟塊，TNBC及非TNBC各26例，均為女性，術(shù)前均未接受放療、化療及其他治療，中位年齡43(23～78)歲。

1.2主要試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS)、EDTA修復(fù)液、抗體稀釋液、DAB顯色劑、中性樹膠、BRCA1單克隆抗體、TopoⅡα單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體等。

1.3主要儀器 不銹鋼壓力鍋、微波爐、吹風(fēng)機(jī)、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學(xué)顯微鏡、純木漿衛(wèi)生紙、圖像采集系統(tǒng)等。

1.4操作步驟 石蠟包埋的組織塊切片，厚度為4 μm，置烤片機(jī)上烤2 h，然后置于60℃恒溫箱過夜。石蠟切片脫蠟水化，PBS液(pH7.4)沖洗3次，每次5 min。取一定量的修復(fù)液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，繼續(xù)加熱至噴氣， 2 min后切斷電源，切片冷卻至室溫以抗原修復(fù)。PBS沖洗3次，每次5 min。3%過氧化氫室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，每次5 min。滴加4%羊血清封閉，室溫30 min，以減少非特異性染色。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2 h，采用已知陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PBS沖洗3次，每次5 min。滴加二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色: 甩去PBS液，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，滿意后以自來水充分沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染:陳舊蘇木素溶液中浸泡1 min復(fù)染細(xì)胞核，0.1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)1～3 min。酒精梯度脫水干燥:75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇各1次，每次5 min;二甲苯透明;中性樹膠封片。顯微鏡下觀察閱片并總結(jié)染色結(jié)果。

1.5結(jié)果判斷 BRCA1蛋白陽(yáng)性染色的棕黃色顆粒主要表達(dá)在細(xì)胞核上。TopoⅡα蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒,位于胞質(zhì)和胞膜,Bcl-2蛋白陽(yáng)性染色的棕黃色顆粒表達(dá)在細(xì)胞膜上,可見細(xì)胞質(zhì)同時(shí)染色。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野(×400)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于20%計(jì)為0分,20%～50%計(jì)為1分,51%～75%計(jì)為2分,大于75%計(jì)為3分，0～1分計(jì)為(-)，2～3分計(jì)為(+)。見圖1，圖2，圖3。

圖1 BRCA1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)(DAB,×400)

圖2 TopoⅡα蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) (DAB,×400)

圖3 Bcl-2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) (DAB,×400)

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間曲線比較用Log-Rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

本研究共納入52例乳腺癌患者，手術(shù)時(shí)間從2005年1月至2006年12月，均有明確的術(shù)后病理診斷及免疫組化結(jié)果。自患者術(shù)后第1天開始截止到2011年10月31日，全部病例死亡12例(23.1%)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移21例(40.4%)。BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2三個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性者較陰性者有較高的總生存率及無(wú)病生存率(見表1)。BRCA1蛋白的表達(dá)情況在TNBC與非TNBC中差異顯著，低表達(dá)與TNBC顯著相關(guān)，而TopoⅡα和Bcl-2蛋白在TNBC與非TNBC中表達(dá)無(wú)顯著差異。見表2。

表1 各蛋白陰、陽(yáng)性表達(dá)組間總生存率及無(wú)病生存率比較(%)

表2 三陰及三陽(yáng)組三種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較〔n(%)〕

3 討 論

BRCA1基因?yàn)閰⑴c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程的一種抑癌基因〔1〕。研究證實(shí),BRCA1突變者在40歲以前發(fā)生乳腺癌的概率高達(dá)19%。BRCA1基因在不同種族和地區(qū)的突變不盡相同，BRCA1可作為輔助診斷和治療乳腺癌的生物標(biāo)記蛋白〔2，3〕。TNBC與BRCA1突變?nèi)橄侔┰诒硇吞卣骱头肿铀缴嫌性S多相似之處，如ER陰性，CK5/6、EGFR和Ki-67陽(yáng)性，P53突變，核分級(jí)較高，預(yù)后較差等。Cleator等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)TNBC中大約有30%伴BRCA1基因突變，而伴BRCA1基因突變的乳腺癌中TNBC占90%。Lee等〔5〕檢測(cè)了1167例乳腺癌患者BRCA1突變情況，發(fā)現(xiàn)48%的BRCA1突變者為三陰乳腺癌，而BRCA1未突變者只有12%為TNBC。本研究提示，BRCA1突變與TNBC之間有著密切的聯(lián)系，故治療BRCA1相關(guān)腫瘤的方法也適合用于治療TNBC。體外試驗(yàn)顯示BRCA1相關(guān)乳腺癌因BRCA1功能失活或缺失導(dǎo)致對(duì)能破壞DNA結(jié)構(gòu)的藥物極其敏感，如鉑類藥物。國(guó)外已進(jìn)行了多項(xiàng)前瞻性或回顧性臨床試驗(yàn)〔6～9〕均證實(shí)了鉑類藥物對(duì)TNBC有較好的療效,尤以BRCA1突變患者對(duì)順鉑更為敏感。

TopoⅡα的基因位于染色體17q21～q22位點(diǎn),與HER-2基因位點(diǎn)相鄰,是蒽環(huán)類藥物的作用靶點(diǎn),其表達(dá)缺失常引起蒽環(huán)類藥物耐藥,而過表達(dá)則對(duì)蒽環(huán)類藥物敏感。目前關(guān)于TopoⅡα的臨床研究結(jié)果并不完全一致。Nielsen等〔10〕指出TopoⅡα基因狀態(tài)可作為患者無(wú)病生存率及總生存率的預(yù)測(cè)因子，TopoⅡα基因缺失者較擴(kuò)增者預(yù)后差。Chan等〔11〕研究亦闡明TopoⅡα基因擴(kuò)增的患者有更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期。但是，Nakagawa等〔12〕卻發(fā)現(xiàn)TopoⅡα過表達(dá)與TNBC的核分級(jí)高、脈管瘤栓顯著相關(guān)。Tan等〔13〕研究表明TNBC患者很少伴有TopoⅡα基因擴(kuò)增。Carey等〔14〕闡明盡管TopoⅡα基因常與Her-2基因共同擴(kuò)增，但蒽環(huán)類藥物對(duì)TNBC患者卻有很好的療效。Park等〔15〕研究指出TopoⅡα基因表達(dá)才是預(yù)測(cè)蒽環(huán)類化療療效的真正標(biāo)志物,而HER-2預(yù)測(cè)蒽環(huán)類療效實(shí)際上是通過TopoⅡα表達(dá)發(fā)揮作用的。本研究中TopoⅡα陽(yáng)性者較陰性者預(yù)后較好，所以對(duì)于TNBC患者檢測(cè)其TopoⅡα基因表達(dá)情況對(duì)指導(dǎo)用藥具有至關(guān)重要的作用。

Bcl-2為目前公認(rèn)的一種細(xì)胞凋亡抑制基因，Bcl-2表達(dá)與腫瘤大小、細(xì)胞增殖程度、腫瘤浸潤(rùn)性密切相關(guān),Poincloux等〔16〕研究顯示Bcl-2低表達(dá)與包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤預(yù)后差有關(guān)。Koronakis等〔17〕研究亦證實(shí)了TNBC與Bcl-2低表達(dá)密切相關(guān)。本研究中Bcl-2陽(yáng)性者較陰性者有明顯的生存獲益，5年OS及DFS均具有顯著性差異，但TNBC與非TNBC中Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯差異。

在2011年ASCO年會(huì)上報(bào)道了Abdel-Fatah等〔18〕的一項(xiàng)研究，對(duì)于接受CMF方案化療的TNBC患者，Bcl-2的表達(dá)與死亡率和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，具體表現(xiàn)為：Bcl-2(+)的患者為低風(fēng)險(xiǎn)，Bcl-2(-)的患者為高風(fēng)險(xiǎn)。以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的新輔助治療是針對(duì)Bcl-2表達(dá)水平低的TNBC患者的有效治療方法，并與較高的病理緩解率密切相關(guān)。故將Bcl-2納入到TNBC表型標(biāo)記有助于制定更好的治療方案，從而最終改善TNBC患者的預(yù)后。

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