中國漢族人群醛固酮合成酶基因編碼區(qū)多態(tài)性

蔡 輝

(婁底市中心醫(yī)院老年科，湖南 婁底 417000)

原發(fā)性高血壓(EH)是多基因疾病。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在血壓調(diào)節(jié)方面起著重要作用。編碼這個系統(tǒng)的基因的分子變異與一些心血管疾病密切相關(guān)，有報道其中的醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的多態(tài)性-344C/T與EH、左心室肥厚、小動脈順應(yīng)性有關(guān)〔1〕。該基因?qū)儆诩?xì)胞色素氧化酶(CYP)基因超家族，精確定位于染色體8q24.3，它含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，與類固醇羥化酶(CYP11B1)基因具有高度同源性，核苷酸序列90%以上相同。位于該基因上的一些點突變可以引起醛固酮合成減少，而該基因啟動子區(qū)-344C/T多態(tài)性與原發(fā)醛固酮增多癥相關(guān)〔2〕。美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)的核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫報道了CYP11B2基因的11個錯義SNPs和位于其他部位的 95個SNPs，數(shù)據(jù)主要由歐美人提交，不同人種SNP分布不同。本研究旨在尋找中國漢族人群中CYP11B2基因編碼區(qū)序列的多態(tài)性。

1 對象與方法

1.1研究對象 31例血壓正常人，年齡40～60歲，收縮壓<135 mmHg，舒張壓<85 mmHg。32例EH病人，年齡40～60歲，收縮壓>140 mmHg和(或)舒張壓>90 mmHg，排除繼發(fā)高血壓等。24例初步診斷原發(fā)醛固酮增多患者，血漿醛固酮與血漿腎素活性的比值(ARR)>50，血漿醛固酮的水平>正常參考值〔(5.79～17.39)ng/dl〕，排除繼發(fā)醛固酮增多癥。

1.2相關(guān)指標(biāo)測定 ①血壓測定：采用標(biāo)準(zhǔn)袖帶臺式血壓儀，按照標(biāo)準(zhǔn)血壓測定方法讀取血壓值，以Krotokof第1音為收縮壓，第5音為舒張壓，每間隔2 min測量1次，共測量3次取平均值。②血漿腎素活性與血漿醛固酮的測定采用放射免疫法(RIA)，醛固酮放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3基因組DNA提取 常規(guī)酚-氯仿-異戊醇法抽提基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定其純度和濃度后，標(biāo)化DNA濃度為200～300 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計 利用Primer 5.0和oligo6.0軟件，以NCBI中的序列(D13752)為參考，針對CYP11B2的外顯子和內(nèi)含子交界處設(shè)計引物，引物由北京奧科公司合成。PCR反應(yīng)試劑購自大連寶生物公司。見表1。

表1 CYP11B2各對引物序列

1.5PCR擴增 50 μl反應(yīng)體系包含：10×PCR 緩沖液5 μl，2.5 mmol/L MgCl24 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，10 μmol/L上游引物1 μl，10 μmol/L下游引物1 μl，DNA 200～300 ng，Taq酶 0.5 U，消毒去離子水補充至50 μl。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃30 s，退火及延伸條件見表2，共32個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果，并將目的條帶割下。

1.6產(chǎn)物回收及測序 按照晶美生物公司的DNA Extraction Kit的說明書進行目的片段的純化回收。將回收產(chǎn)物送往北京奧科公司，以PCR引物為測序引物進行測序。

1.7SNP的篩選 采用Blast，DNAMAN軟件進行多重序列比對。

表2 各對引物的退火溫度及延伸時間

1.8統(tǒng)計分析 統(tǒng)計所發(fā)現(xiàn)的SNPs數(shù)目及各SNP特征，計算每個SNP的基因型頻率和等位基因頻率，與GenBank上公布的數(shù)據(jù)進行比較。再通過在線 (http：//pga.gs.washington.edu/VG2.html)，EMLD軟件和Haploview軟件進行連鎖不平衡分析，并通過在線 (http：//pga.gs.washington.edu/VH2.html)和PHASE2.0進行單體型構(gòu)建。組間基因型和等位基因分布及單體型頻率差異均采用SPSS12.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1所檢測區(qū)域的SNPs概況 經(jīng)CYP11B2基因全部外顯子和部分內(nèi)含子的序列擴增并測序，總計檢測到序列為4 580 bp，發(fā)現(xiàn)18個多態(tài)性位點，有6個SNPs，位點在國外數(shù)據(jù)庫中未見報道，占33%。有一個有意義位點，G5821A。其余的為同義突變或者位于內(nèi)含子區(qū)。見表3。

表3 CYP11B2基因SNPs情況

1)此處SNP位置參考GenBank上的序列(D13752)；435G/S：435甘氨酸/絲氨酸；rs編號為NCBI中dbSNP庫中的號碼，顯示突變位點(下劃線處)兩側(cè)鄰近10個堿基序列

2.2SNPs頻率分布和類型 在18個SNPs中，根據(jù)同一位點次要基因頻率，將其分為低頻(<0.05)，其中SNPs為 5個；中頻(0.05～0.15)，SNPs為6 個；高頻(>0.15)，SNPs為7 個。各組間SNP等位基因頻率和基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3部分SNPs在不同人種中的分布 見表4。

2.4CYP11B2外顯子和部分內(nèi)含子測序圖 黑色箭頭為突變位點。見圖2。

2.5連鎖不平衡分析和單體型構(gòu)建 通過對這些SNPs位點進行在線連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)其中位點1205與1441，3497與3499和3803，3868與3881，存在完全連鎖不平衡，r2=1；位點4918與5160存在較強連鎖，r2=0.9，見圖3和表5。對其中的9個SNPs位點進行單體型分析。其中7種單體型占85.4%，頻率均大于2%，分別為56%，10.8%，4.8%，3.6%，3%，2.4%。

圖1 可視化基因型分布圖

圖2 CYP11B2外顯子及部分內(nèi)含子基因測序圖

圖3 連鎖不平衡分析圖

表4 CYP11B2基因部分SNPs次要等位基因在不同人種中的分布

另外通過PHASE2.0軟件進行精確的單倍體構(gòu)建，結(jié)果與上述在線分析一致。兩種主要單體型111111111111和111101111111的頻率在三組中均大于10%，能解釋69%、64%、75%的個體。在單體型110111111111中原發(fā)醛固酮增多癥組和另外兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；111100000111在原發(fā)醛固酮增多癥組中占5%，而在另外兩組中不存在。見表6。

表5 兩位點間連鎖不平衡分析(通過EMLD軟件)

表6 12個SNP位點組成的7種主要單體型(通過PHASE2.0軟件)

3 討 論

第三代遺傳標(biāo)記單鏈SNP是人類基因組DNA序列中最常見的變異形式，這種多態(tài)性包括單個堿基的缺失和插入以及單個堿基的置換。SNP為一種二等位基因變異，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換與顛換之比為2∶1，在GC序列出現(xiàn)最頻繁。SNP分布不均勻，由于選擇壓力等原因，絕大多數(shù)SNPs位于非轉(zhuǎn)錄序列。SNP其意義與位置有關(guān)：調(diào)控區(qū)SNP可能影響蛋白表達(dá)的水平，編碼區(qū)SNP可能導(dǎo)致氨基酸殘基改變，這兩種SNP都可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變〔3〕。

人醛固酮合成酶主要位于腎上腺皮質(zhì)球狀帶，它能催化脫氧皮質(zhì)酮變成皮質(zhì)酮，另外它還具有18-羥化酶活性和18-氧化酶活性，分別催化皮質(zhì)酮變?yōu)?8-羥化皮質(zhì)酮和催化18-羥化皮質(zhì)酮變?yōu)槿┕掏?。其編碼基因CYP11B2基因含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，與CYP11B1基因相隔40 kb，兩者具有高度同源性，編碼區(qū)序列同源性為95%，內(nèi)含子序列同源性為90%，蛋白質(zhì)相似性為93%。兩者都編碼503個氨基酸殘基，分子量分別為48.5 kD和50 kD。為了能夠保證特異性擴增出CYP11B2的外顯子，而不是CYP11B1，首先通過Blast(www.ncbi.nlm.gov/blast)仔細(xì)比對這兩個序列的各個外顯子和內(nèi)含子，然后在差異明顯處設(shè)計引物的3′末端。

通過對CYP11B2基因9個外顯子和部分內(nèi)含子序列測序，將結(jié)果與已知的SNP信息進行比較，確定CYP11B2基因SNP在中國漢族人群中分布的具體位點和類型：總共檢測出18個多態(tài)性位點，14個為轉(zhuǎn)換，即嘌呤變成嘌呤，嘧啶變成嘧啶。4個位于編碼區(qū)，其中3個為同義突變，分別位于第37、374、390個氨基酸處，變異頻率分別為22%，11.7%，1%，GenBank上登錄的rs編號分別為rs5281，rs4538，rs5313。同義改變不會改變氨基酸但可能會改變剪切部位而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。1個為錯義突變，位于第435個氨基酸處，由甘氨酸變成絲氨酸，變異頻率為23%，rs編號為rs4545。已有研究發(fā)現(xiàn)在一例原發(fā)醛固酮合成減少(皮質(zhì)酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏)的病人DNA序列中存在該變異，體外蛋白質(zhì)功能研究表明該突變可以導(dǎo)致18-羥化酶活性和18-氧化酶活性受損〔4〕。而本次研究中，這個變異在高血壓組中發(fā)現(xiàn)，此病人該處的變異為一雜合突變，并且在整個測序區(qū)段中只發(fā)現(xiàn)這一個變異，其他17個多態(tài)性位點均未檢測到，而該病人的腎素、醛固酮水平正常。此現(xiàn)象似乎與上述研究結(jié)果有矛盾之處，但上述皮質(zhì)酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏的病人的基因變異為純合突變，考慮為基因劑量效應(yīng)的影響。

剩下的14個變異均位于內(nèi)含子區(qū)，有6個未見國外數(shù)據(jù)庫報道，分別是G949A，A1441G，T1457C，T4880C，T4881G，C5264T。次要等位基因頻率分別為43%，14.6%，1%，22%，22%，2.1%。C1205T國外SNP數(shù)據(jù)庫未見登錄，但Nicod等〔5〕在6個糖皮質(zhì)激素抑制的醛固酮增多癥(GRA)病人中檢測到有5個病人存在這個變異，因此認(rèn)為該變異是一種多態(tài)。其余7個在國外數(shù)據(jù)庫中有報道，rs4538在中國漢族人群中的次要等位基因頻率為11.7%，而在國外2種人群中頻率為25%和32.5%。rs4545在中國北京人和日本人群中A等位基因頻率分別為53.3%和46.6%，而在歐洲和非洲人群中分別為1.7%和2.5%，這表明該位點在亞洲黃種人群中的分布類型與歐美白人和非洲黑人相比存在很大的差異。rs5281次要等位基因A頻率為2.2%，與國外報道的2.5%基本一致。rs5313次要等位基因A頻率為1%，而在國外人群中為15%，推測可能與樣本量較少有關(guān)，也有可能是種族差異所致。rs6399，rs6418次要等位基因T頻率均為22.7%，國外人群為均32.5%。rs6434，rs10110732，rs13252628，rs28531895，rs36018151國外數(shù)據(jù)庫未見頻率報道。據(jù)中國少數(shù)漢族人群樣本數(shù)據(jù)顯示，中國漢族人群的SNP分布特點與國外報道的不盡一致，充分說明SNP存在種族遺傳性和地區(qū)遺傳性。

Gordon〔6〕對腎上腺皮質(zhì)腺瘤(APA)做了很深入的基因分析，報道了在腎上腺皮質(zhì)瘤組織里腎素的mRNA水平增加，但編碼腎素，AT1受體，P53的基因均未找到突變。Yoshiyu等〔7，8〕在APA病人體內(nèi)也沒找到突變。Jaresch等〔9〕研究了APA病人體內(nèi)醛固酮分泌增多是否由CYP11B1基因突變引起，但他們未發(fā)現(xiàn)突變。21-羥化酶缺乏參與了腎上腺皮質(zhì)腫瘤的形成〔10〕，Beuschlein等〔11〕研究了21-羥化酶的編碼基因CYP21的mRNA變化，發(fā)現(xiàn)mRNA顯著增高和一個突變點Val281Leu，但這個變異被認(rèn)為是個多態(tài)性。同樣，他們對特發(fā)型醛固酮增多癥(IHA)病人的CYP11B2基因編碼區(qū)測序也未能找到突變。本研究也未在中國原發(fā)醛固酮增多病人中找到有意義的突變。這些結(jié)果提示了CYP11B2基因的某些調(diào)控因素比如未確定的刺激醛固酮生成物質(zhì)或者是基因啟動子區(qū)的異常導(dǎo)致了CYP11B2 mRNA過量表達(dá)。

連鎖不平衡分析表明有9個SNPs存在較強或者完全連鎖不平衡現(xiàn)象，單體型構(gòu)建發(fā)現(xiàn)1種單體型在原發(fā)醛固酮增多組中頻率要高于其他兩組，推測這種單體型可能與原發(fā)醛固酮增多有關(guān)，但本研究的樣本量不夠大，尚需要加大樣本量研究。

中國漢族人群CYP11B2基因編碼區(qū)多態(tài)性位點的分布與頻率與國外人群相比存在著種族差異。這些多態(tài)性位點和單體型為今后的定點突變研究和大樣本人群進行病例-對照關(guān)聯(lián)研究提供了實驗基礎(chǔ)。

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