大鼠腎發育中Cyt-c的表達

龐 娟 宋小峰

(遼寧醫學院，遼寧 錦州 121001)

細胞凋亡是受多種基因精確調控的主動的程序化的死亡過程，在多細胞生物的組織分化、器官發育和機體穩態的維持中發揮著重要的作用〔1〕。細胞色素C(Cyt-c)是線粒體中第一個被鑒定出的細胞凋亡因子，在細胞凋亡過程中Cyt-c釋放進入胞質，是線粒體釋放的最重要的促凋亡因子之一〔2〕。細胞凋亡在腎各結構的發育中起著重要的作用〔3，4〕。目前，有關腎發育中細胞凋亡的相關研究國外已有一定報道，但正常腎發育中凋亡相關蛋白Cyt-c的表達及作用的系統研究還很少見，其對腎發育的影響還有待進一步的完善〔5〕。本研究擬探討大鼠腎發育中Cyt-c的表達規律及對腎發育的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物和抗體 選用成年健康SD大白鼠，雌、雄(2∶1)同窩飼養,3次/d觀察受孕情況，以觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡(E)0 d。孕鼠分籠飼養2 w后，2次/d觀察生產情況，以觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后(P)0 d。選取E16、18、20 d的胎鼠和P1、3、5、7、14、21 d的仔鼠，每組取6只。

抗體：鼠抗Cyt-c單克隆抗體(購于Abcam公司)； PV試劑盒(購于北京中杉試劑公司)。

1.2石蠟切片的制備 各齡孕鼠經腹腔注射水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，各齡胎鼠剖腹取腎；生后各齡仔鼠經乙醚麻醉后，經4%多聚甲醛與1%戊二醛灌流固定，取腎，常規脫水透明，石蠟定向包埋，連續切片(5 μm厚)。

1.3PV法檢測Cyt-c陽性表達細胞 將石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶；高溫高壓修復，室溫下冷卻；鼠抗Cyt-c單克隆抗體 (1 μg/ml)濕盒內4℃過夜;羊抗鼠IgG,37℃20 min; 二氧基聯苯胺(DAB)顯色;蘇木精復染、脫水、透明、封片;以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，光鏡下觀察。

1.4免疫印跡法檢測細胞增殖 收集待用腎組織，加入100 μl 蛋白提取緩沖液，于組織勻漿機上勻漿后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，置于-70℃備用。電泳前，加入十二烷硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離，然后將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h， 鼠抗Cyt-c單克隆抗體(1 μg/ml)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜10 min 3次，辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG(1∶2 000)二抗孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，增強化學發光法(ECL)顯影。

圖1 Cyt-c蛋白免疫組織化學顯色

2 結 果

2.1Cyt-c蛋白免疫組織化學顯色 見圖1。Cyt-c陽性表達定位于細胞質上，呈不同程度的棕黃色顆粒狀，而Cyt-c陰性細胞的細胞核被蘇木精染成藍紫色。從E16～20 d時，皮質區Cyt-c的陽性細胞主要出現于近髓質區的近端小管和遠端小管內，近端小管的表達強于遠端小管，腎小體內的陽性表達細胞極少見；髓質區的陽性表達細胞主要出現在與梯狀間充質垂直排列的放射狀小管內。P1～7 d時，皮質區Cyt-c的陽性表達細胞隨著生腎區的變薄逐漸增多，主要表達中層和深層的腎皮質區，髓放線的陽性表達細胞也逐漸增多，但仍集中在放射狀小管上。P14～21 d時，皮質區的陽性表達細胞位于皮質全層；髓質區的陽性表達細胞較多，以外髓放射狀走行的小管居多。

2.2免疫印跡分析結果 免疫印跡結果顯示，大鼠腎發育中Cyt-c的蛋白表達從E16 d～P7 d逐漸升高，P7 d時達到高峰，以后則逐漸降低，在P7 d后表達微弱。見圖2。

圖2 免疫印跡結果分析

3 討 論

本研究結果顯示，隨著發育的不斷進行，Cyt-c的表達從皮質的近髓質區逐漸擴展到整個皮質區，其表達主要分布于近端小管和遠端小管。

Cyt-c是一個水溶性蛋白質，與線粒體內膜呈松弛相連〔6〕。當發生細胞凋亡時，在凋亡信號的作用下，Cyt-c釋放到細胞質并與凋亡蛋白激活因子半胱氨酸蛋白酶原(Apaf-1)聚合，聚合的Apaf-1募集并活化半胱氨酸蛋白酶(pro-caspase-9),caspase-9激活下游的效應酶caspase-3,最終引發線粒體途徑介導的細胞凋亡。因此，Cyt-c陽性細胞的多少可以反映細胞的凋亡狀態，其表達與線粒體的含量及分布有一定的相關性〔7，8〕。腎近端小管和遠端小管的胞質內含有豐富的線粒體。本研究顯示，在大鼠胚胎及生后腎的發育過程中Cyt-c均有不同程度的表達，且主要表達于近端小管和遠端小管，這或許表明由Cyt-c線粒體通路介導的細胞凋亡與大鼠腎發育密不可分。

本實驗發現，Cyt-c的表達從E16 d～P7 d逐漸升高，P7 d達到高峰；通過對腎發育過程中細胞增殖的研究也發現增殖的細胞在P7 d達到高峰，這表明在腎的發育過程中，細胞增殖和細胞凋亡維持著動態平衡，細胞凋亡維持了生物體數目的動態平衡，以消除那些注定要死亡的細胞，以免導致發育異?；蚰[瘤〔9〕。

在腎發育過程中伴隨著細胞生長分化的同時也發生了大量的細胞凋亡，而凋亡過程受到機體的嚴密監控。對Cyt-c的深入研究將有助于揭示腎發生發育的機制，并為腎疾病的預防及治療提供新思路。

4 參考文獻

1Wyrwicz-Zielinska G, Fedak D, Kuzniewski M,etal.The relationship between serum soluble apoptosis marker (sTRAIL) concentration and nutritional parameters in hemodialyzed patients〔J〕. Przegi Lek, 2013;70 (7):427-30.

2李 慢，韓 芳，石玉秀.細胞色素C氧化酶在PTSD大鼠藍斑神經元過表達〔J〕. 解剖科學進展, 2010; 16(2):140-2.

3Ye Y, Wang B, Jiang X,etal. Proliferative capacity of stem/progenitor-like cells in the kidney may associate with the outcome of patients with acute tubular necrosis 〔J〕. Hum Pathol, 2011; 42(8): 1132-41.

4Mozaffar MS, Abdelsated R, Liu JY,etal. Renal diatal tubule proliferation and increased aquaporin-2 level but decreased urine osmolality in db/db mouse;treatment with chromium picolinate 〔J〕. Exp Mol Pathol, 2012; 92(1): 54-8.

5Zhang A, Fu S, Chen L,etal. Lacidipine attenuates apoptosis via a caspase-3 dependent pathway in human kidney Cells 〔J〕. Cell Physiol Biochem, 2013;32(4):1040-9.

6Faccenda D, Tan CH, Duchen MR,etal. Mitochondrial IF1preserves cristae structure to limit apoptotic cell death signaling〔J〕. Cell Cycle, 2013;12(16):2530-2.

7Ng H, Smith DJ, Nagley P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/ DIABLO from mitochondria during cell death signaling〔J〕. PloS One,2012;7(7)：e42298.

8Zhang ZF, Guo Y，Zhang JB,etal.Induction of apoptosis by chelerythrine chloride through mitochondrial pathway and Bcl-2 family proteins in human hepatoma SMMC-7721 cell〔J〕.Arch Pharm Res,2011;34(5): 791-800.

9Tang N, Jin J, Deng Y,etal. LASS2 interacts with V-ATPase and inhibits cell growth of hepatocellular carcinoma〔J〕. Sheng Li Xue Bao,2010;62(3): 196-202.