電針對去卵巢大鼠學習記憶及海馬乙酰膽堿轉移酶的影響

唐 曦 唐成林 劉仁建

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016)

絕經后婦女用雌激素替代治療可提高絕經后婦女的認知和記憶能力〔1〕。膽堿能系統在中樞神經系統分布廣泛，其作用以興奮為主，廣泛影響中樞神經系統功能，其中包括在促進學習和記憶方面所起的重要作用，且與海馬的膽堿能系統直接相關〔2〕。 在臨床上，針灸對治療老年婦女認知功能障礙有一定的療效，但其作用機制尚不清楚。本實驗采用卵巢切除大鼠模型，造成低雌激素記憶障礙，觀察電針對去卵巢大鼠行為學，體內雌激素水平及海馬乙酰膽堿轉移酶(CHAT)生成的影響，探討電針改善絕經后婦女認知功能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組、模型制備 健康雌性SD大鼠40只，3月齡，體重160～200 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號: SCXK(瀘)2007-0005。 采用隨機數字法將大鼠隨機分成假手術組；模型組；電針組；假電針組，每組10只。10%水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)按0.3 ml/100 g，腹腔注射麻醉。假手術組切除卵巢周圍(DOX)脂肪，其余各組均實行雙側卵巢切除術。假手術組和模型組術后不予任何處理；電針組切除卵巢2 w后予電針刺激，選穴方法按華興邦氏的方法實施，選取“足三里”“腎俞”兩穴，在不麻醉的狀態下采用一次性細美容針刺入穴位，雙側足三里穴接通韓氏電針儀(南京濟生醫療科技有限公司)，刺激參數：連續脈沖波，頻率3～4 Hz，強度4～5 mA，以使大鼠后肢抖動為宜，在上午9時開始，每次20 min，隔日1次，連續治療3個月；假電針組針刺操作同電針組，但不接通電針儀。水迷宮測試結束后，將大鼠麻醉,頸總動脈取血，分離血清。在冰面上斷頭取腦，并迅速分離海馬組織，立即將海馬組織置液氮中，于-80℃低溫冰箱保存，用于組織蛋白和組織mRNA的提取。

1.2Morris水迷宮測試 于造模前后、治療后進行測試。

1.2.1定位航行試驗 歷時4 d，每天上下午各2次，將大鼠面向池壁，分別從4個入水點放入池中，記錄大鼠尋找到并爬上平臺所需時間即為逃避潛伏期時間。

1.2.2空間探索試驗 定位航行試驗后,去除平臺，將大鼠任選一個入水點將大鼠放入池中，測定其在120s內跨越平臺位置的次數。

1.3競爭性抑制酶免疫分析法(ELISA) 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內壓實自封條，密封口袋，放回4℃。空白孔加標本或標準品稀釋液，其余相應孔中加標本或不同濃度標準品(100 μl/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90 min。提前前20 min準備生物素化抗體工作液。 洗板5次。空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μl/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60 min。提前前20 min準備酶結合物工作液。避光室溫(22℃～25℃)放置。洗板5次。空白孔加酶結合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液(100 μl/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30 min。打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。洗板5次。加入顯色底物100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15 min。加入終止液100 μl/孔,混勻后即刻測量450 nm下外直徑(OD)值(3 min內)。

1.4Western 印跡 從-80℃低溫冰箱中取出大鼠海馬組織，加入400 μl裂解液 勻漿后，充分裂解。離心10 min。將上清分裝，存于-70℃備檢。牛血清白蛋白(BSA)50 mg，加雙蒸水到50 ml,配置成終濃度為1 g/L的蛋白標準液。測定并繪制標準曲線，取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮藍G250染液990 ml，測定595 nm OD值，然后在標準曲線上求所得濃度。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為70 μg，并于95℃～100℃ 5 min后冰上冷卻上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓80 V約30 min，分離膠100 V約90 min。取出凝膠，置于轉移緩沖液中平衡15 min。準備濾紙及NC膜，分別置入轉移緩沖液及去離子水中。平放底部電極(陽極)，在上面分別放置濾紙、NC膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流200 mA通電，電轉移100 min。PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(4℃，過夜)，棄去封閉液，不洗。按約0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體CHAT(1∶400 Santa Cruz)搖床搖蕩孵育(4℃，過夜)。PBST漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與HRP結合的二抗(辣根過氧化酶標記抗體)，二抗用封閉液稀釋(1∶5 000)室溫下搖蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。按0.1 ml/cm2顯影液計算用量，將顯影液加于PVDF膜上，室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機中顯影、洗像。調整曝光時間，直至出現最佳條帶。應用生物凝膠電泳圖像分析系統掃描定量， 對各特異性蛋白條帶與相應的內參條帶進行灰度掃描，以兩者比值作為該蛋白合成的相對量。

2 結 果

2.1Morris水迷宮法行為學檢測結果 造模前,各組逃避潛伏期時間及跨越平臺次數無顯著差異(P>0.05)，說明造模前大鼠的認知條件相同；造模后，模型組、假電針組、電針組與造模前比較，大鼠逃避潛伏期時間明顯延長，跨越平臺次數明顯減少(P<0.05)，說明大鼠去卵巢后雌激素水平降低，導致大鼠學習記憶能力減低；電針治療后，電針組逃避潛伏期時間明顯縮短，跨越平臺次數明顯增加，與治療前及模型組有顯著差異(P<0.05)，與假手術組無顯著性差異(P>0.05)。假電針組雖有改善，但仍與假手術組、電針組之間有顯著性差異(P<0.05)，說明電針能夠提高去卵巢大鼠空間學習記憶能力，逆轉記憶損傷。見表1、表2。

2.2電針對去卵巢大鼠血清E2的影響 治療后3個月，模型組大鼠血清E2水平較假手術組顯著下降〔(56.47±6.70) pg/ml,P<0.01〕，電針組血清E2水平較模型組明顯上升〔(38.16±5.44) pg/ml,P<0.05〕，但仍未達到假手術組水平〔(65.13±7.72)pg/ml，P<0.01〕，假電針組雖血清E2水平(49.29±5.90)pg/ml較模型組有所上升，但仍與假手術組、電針組之間有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)。結果表明電針能夠提高血清E2的水平。

表1 各組大鼠 Morris 水迷宮逃避潛伏期測試成績比較

表2 各組大鼠Morris水迷宮跨越平臺數測試成績比較

2.3電針對去卵巢大鼠海馬區CHAT蛋白的影響 與假手術組(0.62±0.40)比較，模型組大鼠海馬CHAT蛋白表達顯著降低(0.33±0.06,P<0.01)，與模型組比較，電針組CHAT蛋白表達顯著升高(0.50±0.05，P<0.01)，但仍未達到假手術組水平(P>0.05)。假電針組蛋白表達雖略有升高(0.37±0.42)，但與模型組無顯著性差異(P>0.05)。結果表明電針能夠上調去卵巢大鼠海馬區CHAT蛋白表達。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CHAT蛋白表達

3 討 論

本實驗采用去卵巢大鼠動物模型，造成低雌激素記憶障礙。OVX是一種較好的制備雌激素缺乏模型方法〔3〕。去卵巢大鼠模型不僅有類似絕經婦女雌激素水平的變化和全身多系統衰老的表現，該模型還表現為基底前腦膽堿能系統及海馬突觸功能降低，而且出現相應的學習記憶功能障礙〔4〕，是一種較好的研究絕經后中樞神經系統退行性變的模型，已被廣泛用于觀察體內雌激素減少對機體功能活動影響的實驗中。Luine〔5〕等研究表明大鼠OVX可使其學習、記憶功能明顯下降，并出現海馬CHAT 活性明顯降低。故本實驗采用雙側卵巢切除術制備雌激素缺乏模型，觀察海馬CHAT蛋白表達水平的變化。

Morris水迷宮測試是目前廣泛使用的一種評估嚙齒類動物空間學習記憶能力的方法〔6〕。本實驗利用 Morris 水迷宮定位航行實驗和空間探索實驗檢測去卵巢大鼠行為學改變及電針對學習記憶的影響。研究結果表明去卵巢大鼠的學習記憶能力明顯下降。電針組與假電針組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，且電針組改變更明顯。說明從行為學角度評價，電針可改善去卵巢大鼠的學習記憶能力。

大腦海馬結構是參與學習記憶的重要神經核團，與學習、記憶密切相關，是記憶儲存場所，海馬腦區的正常結構是維持動物正常神經行為功能的物質基礎，同時也是衰老性變化出現早且最顯著的腦區之一，海馬結構的損傷可造成學習記憶功能障礙。海馬膽堿能系統的興奮是學習、記憶、意識的基礎。大量的研究已經明確證實記憶功能高度依賴于膽堿能系統結構和功能的完整性。Bartus等〔7〕著名的“老年記憶障礙的膽堿能假說”認為腦組織中膽堿能神經元的功能失調在實質上導致了一些老年個體和AD病人認知功能的降低。乙酞膽堿是和學習記憶有關的重要神經遞質，海馬的膽堿能神經元活動與學習、記憶有密切關系〔8〕。中樞膽堿能系統在學習記憶中起重要作用，海馬直接參與信息的貯存和回憶，且予海馬膽堿能系統由直接關系〔9〕。以乙酞膽堿為神經遞質的中樞膽堿能神經是構成學習記憶的重要生物學基礎，其正常功能是學習、記憶的必要條件。膽堿乙酰化轉移酶是乙酰膽堿合成的關鍵酶，是膽堿能神經系統功能變化的重要標記〔10〕。Singh等〔11〕報道，OVX 導致大鼠回避反應減少和空間記憶減退，其大腦皮質和海馬對合成 Ach 的原料膽堿的高親合力攝取減少，CHAT 活性降低。中樞膽堿能系統受神經營養因子和雌激素的雙重調節〔12〕，雌激素的長期缺乏影響膽堿能神經元的生長與存活。

本研究觀察說明電針能提高體內雌激素水平，并且CHAT蛋白表達受體內雌激素水平變化的影響，提示老年婦女認知功能的減退與體內雌激素水平和海馬CHAT蛋白表達降低有關。有研究已表明針刺可維持衰老時腦內乙酞膽堿的含量，并調節膽堿能系統的功能活動〔13〕，改善學習記憶功能。針刺可使老化小鼠膽堿酯酶的活性降低，海馬及紋狀體內乙酞膽堿含量增加〔14〕。與本研究結果一致。本研究表明，電針對大鼠腦海馬CHAT蛋白表達有調整作用，故電針可能通過調節腦內CHAT的表達，促進膽堿能神經元的存活、分化、再生,從而減輕受損腦組織的病理改變,提高雌激素缺乏去卵巢模型大鼠的學習、記憶能力，為電針用于臨床治療癡呆類等中樞神經系統退行性病變提供理論依據。電針影響學習記憶的作用機制是多方面的，這可能和電針使體內雌激素的水平升高從而上調海馬CHAT表達有關，也可能和電針對神經內分泌的整體調節有密切關系，電針也可通過影響腦內某些神經遞質如內腓肽、P物質NPY等調節雌激素受體的表達〔15〕。因此電針在改善學習記憶功能和治療老年癡呆癥的作用途徑亦可能是很復雜的，更深入的作用機制尚需進一步研究。

4 參考文獻

1Duka T,Tasker R,Mcgowan JF.The effects of 3 week estrogen hormone replacement on cognition in elderly healthy females〔J〕.Psychopharmacology(Ber1),2000；149(2):129.

2Chen BY,Chen LH,Gao H.Eeffct of electroacupuncture on expression of estrogen receptor protein and mRNA in rat brain〔J〕.Acta Phsiol Sini，1998;50:495-500.

3Paech K，Webb P，Kuiper GGJM，etal.Differential ligand activation of estrogen receptors ERa and ERβ at AP1 sites〔J〕.Science，1997；277：1508.

4Simpkins JW，Green PS，Gridley KE，etal.Role of estrogen replacement therapy in memory enhancement and the prevent of neuronal loss associated with Alzheimer′s disease〔J〕.Am J Med，1997；103(3A)：19S-25S.

5Luine VN.Estradiol increases choline acetyltransferase activity in specific basal Forebrain nuclei and projection areas of female rats〔J〕.Exp Neurol，1985;89:484

6Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.J Neurosci Methods,1984；11(1):47-60.

7Bartus RT,Dean RL，Beer B，etal.The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction Science,1982；217(4558):408-14.

8Chen BY，Chen LH，Gao H.Eeffct of electroacupuncture on expression of estrogen receptor protein and mRNA in rat brain〔J〕.Acta Phsiol Sini，1998;50:495-500.

9Lathe R.Hormones and the hippocampus〔J〕.J Endocrinol，2001；169:205-31.

10Lyness SA，Zarow C，Chui HC.Neuron loss in key cholinergic and aminergic nuclei in Alzheimer disease:a meta-analysis〔J〕.Neurobiol Aging，2002;24(1):1-23.

11Singh M,Meyer EM,Millard WJ.Ovarian steroid deprivation results in a reversible learning impairment and compromised cholinergic function in female SD rats〔J〕.Brain Res,1994；644:305-12.

12Gibbs RB.Levels of TrKA and BDNF mRNA in the basal forebrain and formation of adult rats〔J〕.Exp Neurol,1994；129:70-80.

13Gong X，Wang YJ.Research overview of regulation effect of acupuncture and maxibustion on endocrine function〔J〕.Chinese Acupunct Maxibust，1997;(9):135-7.

14Zhao LH.Advances in experimental research on acupuncture and moxibustion cerebral aging〔J〕.Acupunct Res，2001;26:77-9.

15金 敏,黃荷鳳,金 帆.不同雌激素對大鼠海馬和腦皮質區域雌激素受體a和β表達的差異性調節〔J〕.中國病理生理雜志，2004；20(8):1422-6.