硫化氫對脂多糖所致急性肺損傷大鼠血漿和肺組織中炎性細胞因子的影響

代慶春 韓 玉 苗曉云 周曉紅 沈洪麗 張曉衛

(滄州市中心醫院重癥醫學科，河北 滄州 061001)

脂多糖(LPS)所致急性肺損傷(ALI)的基礎是全身性炎性反應綜合征(SIRS)，而SIRS的本質則是失控的或過度的炎性反應〔1，2〕，且SIRS在ALI發展為成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)的過程中也起著至關重要的作用。目前認為炎癥失控是ALI形成的重要原因，而前炎癥因子被過度產生，抗炎因子相對或絕對產生不足則是造成炎癥失控的根本，也就是所謂的炎癥失衡。如何重建促炎反應與抗炎反應間的平衡，已成為阻斷炎癥介質的瀑布式反應的關鍵。顧儉勇〔3〕已證實，在LPS致大鼠ALI后血漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-4的改變。前期實驗已經證實硫化氫(H2S)對LPS所致ALI具有對抗LPS所致的肺損傷保護細胞的作用。然而H2S的保護作用與細胞因子的相關性尚不十分清楚。本文探討H2S在LPS所致ALI中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1動物 清潔級健康雄性SD大鼠210只，購買后實驗室飼養1 d，使動物適應實驗室環境，由河北省實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1主要試劑 大腸桿菌脂多糖(LPS E.coli O111:B4)、(NaHS)、炔丙基甘氨酸(PPG)均購置于美國Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-4 ELISA-kit試劑盒購置于法國Diaclone公司。

1.2.2動物模型復制、分組及標本制備 大鼠經乙醚吸入麻醉，仰臥位固定。無菌條件下在頸前正中做長約0.5 cm的切口暴露氣管，以7號無菌針頭刺入氣管，在大鼠豎直位下緩慢滴注藥物。滴注以后縫合切口。動物清醒之后，自由活動，禁食，未禁水。將112只大鼠隨機分為四組，每組28只，分別取7只于給藥2、4、6、8 h后進行觀察。在實驗結束前的30 min，給大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，經舌靜脈注入肝素(1 250 U/kg)抗凝，頸部正中切口，頸總動脈插管后放血，留取血漿-80℃保存待分析；同時留取右肺中葉，用以制備肺組織勻漿。對照組：氣管內滴注無熱原生理鹽水(200 μl)；LPS組：氣管內滴注LPS(200 μg/200 μl)；LPS+NaHS組：氣管內滴注LPS前15 min經腹腔注射0.5 ml NaHS(28 μmol/kg)；LPS+PPG組：氣管內滴注LPS前15 min經腹腔注射0.5 ml PPG(45 μmol/kg)。

1.2.3血漿中細胞因子含量 取-80℃保存的血漿應用細胞因子ELISA法，按照試劑盒說明書操作，測定各組給藥2、4、6、8 h后血漿中TNF-α、IL-6、IL-4濃度。

1.2.4組織勻漿中細胞因子含量 凍存的組織標本稱重后置于勻漿緩沖液中(4℃)，每毫升緩沖液100 mg組織。緩沖液中含蛋白酶抑制劑的混合物，即1 mmol/L PMSF、1 mg/L 胃蛋白酶抑制劑 A、1 mg/L抑肽酶、1 mg/L 亮抑肽酶溶于含5 g/L Triton X-100的PBS中(pH 7.2)。標本勻漿后以18 000 r/min離心。使用上述ELISA試劑盒分析組織上清液中TNF-α、IL-6及IL-4濃度。

2 結 果

2.1H2S對LPS所致ALI大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-4水平的影響 對照組大鼠血漿TNF-α、IL-4的濃度低于檢測的下限。各組大鼠血漿中細胞因子的濃度隨LPS的刺激而升高，TNF-α、IL-6及IL-4的濃度于滴注LPS后2 h、4 h、6 h達到高峰。LPS+PPG組大鼠血漿TNF-α、IL-6及IL-4的濃度達高峰時間點為LPS滴注后2 h、4 h、8 h； LPS+NaHS組大鼠血漿TNF-α、IL-6及IL-4的濃度達高峰時間點為LPS滴注后2、4、4 h。與對照組相比，LPS組大鼠各時間點的血漿TNF-α、IL-6、IL-4濃度均升高。與LPS組相比， LPS+PPG組大鼠于各時間點上血漿TNF-α、IL-6濃度更高，但血漿IL-4濃度在LPS滴注后2、4、6 h下降，8 h升高； LPS+NaHS組大鼠各觀察時間點的血漿TNF-α、IL-6濃度降低，但血漿IL-4濃度在LPS滴注后2、4 h升高，6、8 h下降(P均<0.01)。見表1～表3。

表1 滴注后不同時段大鼠血漿中TNF-α含量的變化

表2 滴注后不同時段大鼠血漿中IL-6含量的變化

表3 滴注后不同時段大鼠血漿中IL-4含量的變化

2.2H2S對LPS所致ALI大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-4水平的影響 各組大鼠肺組織中細胞因子的濃度隨LPS的刺激而升高，TNF-α、IL-6及IL-4的濃度分別于LPS滴注后2、4、6 h達到高峰。和對照組相比，LPS組大鼠各觀察時間點血漿的TNF-α、IL-6、IL-4濃度都升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與LPS組相比，LPS+PPG組大鼠各時間點血漿TNF-α、IL-6濃度更高，但血漿IL-4濃度在LPS滴注后2、4、6 h下降，8 h升高； LPS+NaHS組大鼠各時間點的血漿TNF-α、IL-6濃度都有降低，但血漿IL-4濃度在滴注LPS后2、4 h升高，6 h、8 h下降，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表4～表6。

表4 滴注后不同時段大鼠肺組織TNF-α含量的變化

表5 滴注后不同時段大鼠肺組織IL-6含量的變化

表6 滴注后不同時段大鼠肺組織IL-4含量的變化

3 討 論

近幾年研究提示ALI的發生不再局限于單純的肺部疾病，而是一種廣義的，是一種全身系統炎性疾病的肺部臨床表現，即多種病因(包括肺內或肺外，感染或非感染)都能直接或間接地引起ALI及ARDS〔1，2〕，隨著疾病的進展勢必會有更多的炎性細胞被激活，并釋放更多的炎性介質或細胞因子，損害信號將進一步放大和加強，形成炎癥瀑布效應。肺部多種炎性細胞(如中性粒細胞PMN、肺泡巨噬細胞AM等)所介導的肺部炎性反應及失控的炎性反應是造成ALI的根本原因〔3〕。臨床上造成ALI的原因中細菌內毒素是主要病因，其中又以革蘭陰性細菌內毒素為主導，而其內毒素的主要活性成分為脂多糖。LPS所致ALI的本質是造成肺部的嚴重炎性反應及炎性損傷，其過程中不僅有炎癥介質的過度釋放，而且還伴有內源性抗炎介質的異常釋放。有多種細胞因子參與了此過程。在損傷早期，主要參與的炎癥因子有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等。同時在炎癥反應發展的過程中，機體還會分泌抗炎性細胞因子來維持機體內環境的穩定〔4，5〕， IL-4、IL-10、IL-13即是重要的抗炎細胞因子，促炎因子和抗炎因子常處在平衡/失衡不斷變化之中。

T淋巴細胞在調節疾病進展方面有著重要的作用，其中輔助性T細胞(Th)的作用越來越受到人們的關注。根據Th亞群的不同，將Th分泌的細胞因子分為Th1型和Th2型，兩者之間的動態平衡對機體是十分重要的。而兩者的標志性細胞又分別為TNF-α與IL-4，所以調控兩者之間的動態平衡也很重要。

小劑量TNF-α能參與自身防御，增強PMN的吞噬功能，促進SOD活性，使炎癥局部化，提高存活率；但ALI時過度產生的TNF-α則對機體產生了較大的傷害，因此其被認為是ALI時炎癥介質級聯反應的啟動因子〔6〕。它可以加強PMN的趨化并在肺內聚集，從而激活單核/巨噬細胞、PMN等釋放更多的炎癥介質；隨后內皮被激活，PMN的黏附作用加強了，肺微血管通透性也增加了，肺順應性相應降低，最終導致了ALI〔7，8〕。相關研究認為，細胞因子TNF-α在過度炎癥反應中起重要的作用。

IL-6是一種具有多潛能的細胞因子。不僅能對組織直接造成傷害，還能增強組織細胞對TNF-α的敏感性〔9〕。而且在SIRS反應中，LPS不僅可直接誘導機體產生IL-6，同時在TNF-α誘導下機體會產生IL-1β；而IL-1β又可刺激IL-6的生成。由此我們可以看出，IL-6在SIRS病理生理發生發展的過程中起著重要的作用〔10～14〕。

IL-4是由單核細胞、淋巴細胞產生并釋放的，因其能抑制LPS誘導前炎性細胞因子的產生，所以被歸為抗炎細胞因子，但實際上它是多效性的細胞因子。它也可以被TNF-α誘導合成，只是與IL-6的途徑不同而已。

本研究提示了TNF-α可經IL-1β誘導產生IL-6的可能，內源性H2S生成減少可能是前炎性細胞因子增多的原因之一，外源性H2S可以抑制LPS所致ALI大鼠血漿和肺組織中TNF-α、IL-6濃度水平的升高，說明在LPS所致的ALI中，H2S保護細胞的機制之一，就是能夠抑制促炎因子的增加，從而減輕機體過度的炎癥反應。

本實驗還發現，IL-4也參與了LPS所致ALI的炎癥反應過程，并且可以看出抗炎反應要晚于促炎反應。這提示在炎癥早期主要是促炎因子的大量釋放,是機體為了抵御內毒素的入侵，將炎癥反應擴大化的一個過程，但隨著促炎信號的不斷放大，機體又為了避免其對機體造成過大的傷害并對機體進行修復，則會不斷產生抗炎因子并抑制促炎因子的釋放，來維持促炎/抗炎之間的動態平衡，使炎癥局限化并好轉。在早期多種炎性細胞的激活和一系列炎性介質的釋放，雖然會對機體造成一定的損傷，但總體來說是有益的。但如過度的反應，就會形成炎癥瀑布效應，對機體造成致命性的打擊。而抗炎介質也是一樣，在炎癥反應發生時，其使之趨于局限化，對維持機體內環境的穩定，避免過度的炎性損傷是有利的。但如果抗炎介質過量，就會造成機體免疫功能低下而使其易感性增加。所以維持促炎/抗炎之間的動態平衡，能夠恰當地發揮其作用將是研究的主題。

本研究不僅發現了IL-4參與了LPS所致ALI的炎癥反應過程，還證明H2S是通過促進抗炎因子的表達并使其釋放高峰提前來對抗LPS所致ALI，可以看出H2S對炎性因子有著較大的影響，其不僅能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-6的表達，而且還可以促進抗炎因子IL-4的表達并使其釋放高峰提前來減輕機體過度的炎癥反應，從而對抗LPS所致ALI。

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