不同提取工藝制備的五年生種植人參對小鼠免疫功能的影響

洪 凌 狄良嬌 劉姝男 趙 晶 睢大筼 徐華麗 姜英子 洪 鐵

(延邊大學醫學院麻醉系，吉林 延吉 133002)

人參對神經系統〔1,2〕、心血管系統〔3,4〕、血液系統〔5,6〕、消化系統〔7〕、內分泌系統〔8〕、免疫系統〔9,10〕及泌尿生殖系統〔11〕都有調節作用。目前國際市場上，美國、加拿大、日本、韓國等發達國家已把人參作為食品應用，中國在20世紀90年代之前部分人參制品被允許作為食品在市場上銷售，但2002年衛生部發布《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》，人參被列入《可用于保健食品的物品名單》中，被局限于保健品食用范圍，為了更好的利用人參資源，2012年衛生部年根據《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》，批準人參(人工種植)為新資源食品。為探討人參(人工種植)食用對免疫系統的調節作用，本文擬探討人參原粉、水提取物及乙醇提取物對正常成年小鼠免疫功能影響的研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 ICR小鼠，清潔級，由吉林大學實驗動物中心提供，動物合格證號：(吉)2008-0005。

1.2實驗藥品 實驗用生曬參(5年生)產于吉林撫松縣。人參原粉系200目的細粉；人參水提物系兩次水煎煮提取，過濾，濃縮，烘干得人參干粉末，提取率為40.09%，其中人參總皂苷含量約為0.99%，人參多糖含量為7.54%；人參醇提物系70%乙醇加熱回流提取人參粗粉，過濾，濃縮，烘干得人參浸膏，提取率為30.8%，其中人參總皂苷含量約為2.33%，人參多糖含量為0.76%。上述三種實驗藥品均由長春中醫藥大學研發中心生物工程實驗室提供，批號分別為：20101216、20110407、20110331。

1.3給藥方式及方法 將100只正常成年ICR小鼠隨機分為10組，即：對照組，5年生種植人參原粉小、中、大劑量(0.35、0.75、1.4 g生藥/kg)組，5年生種植人參水提物小、中、大劑量(0.35、0.75、1.4 g生藥/kg)組，5年生種植人參醇提物小、中、大劑量(0.35、0.75、1.4 g生藥/kg)組，每組10只。各組小鼠均每天灌胃給藥 1次，連續3 個月。

1.4實驗試劑 胎牛血清，中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號：20081028； RPMI-1640培養液，Gibco公司；青霉素、鏈霉素，華北制藥股份有限公司；噻唑藍(MTT)， Fluka公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市大茂化學試劑廠。

1.5實驗儀器 Bio-rad 680型酶標儀，美國伯樂Bio-rad公司生產；CO2培養箱為日本三洋(Sanyo)公司生產； TGL-16G-A型低溫離心機，上海安亭科學儀器廠生產。

1.6細胞株 L929細胞株由吉林省腫瘤醫院提供。

1.7方法

1.7.1正常成年小鼠免疫器官測定 取ICR小鼠100只，隨機分為十組，每組10只，組別與給藥劑量如表1所示，實驗組每日1次連續灌胃給藥90 d，正常組灌服同體積蒸餾水末次給藥24 h后，稱量體重，摘出胸腺及脾，稱重，計算胸腺指數和脾臟指數，公式如下：胸腺指數=胸腺重(mg)÷體重(g)；脾臟指數=脾重(mg)÷體重(g)。

1.7.2正常小鼠巨噬細胞吞噬功能的測定 取ICR小鼠100只，組別與給藥劑量如表2所示，給藥組每日一次連續灌胃給藥90 d，正常灌服同體積蒸餾水末次給藥24 h后，每鼠腹腔注射5% 雞紅細胞0.4 ml，8 h后將動物處死，仰位固定于鼠板，消毒腹部，剪開皮膚，經腹腔注入生理鹽水2 ml，轉動固定板1 min，然后抽取腹腔液1 ml滴于干凈載玻片上，每片0.2 ml，共2片，放在墊有濕紗布的搪瓷盒中，置于37℃孵箱中溫育30 min，取出玻片，用生理鹽水漂洗，以除去未貼片的細胞。晾干，以丙酮-甲醇液(1∶1)固定5 min，再用4%姬姆薩-瑞特氏染色液染色3 min，用蒸餾水漂洗，晾干。在顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬情況，按下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數：吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數÷200個巨噬細胞×100%，吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數÷200個巨噬細胞。

1.7.3正常自然殺傷細胞活性的測定 取ICR小鼠100只，給藥組每日1次連續灌胃給藥90 d，正常灌服同體積蒸餾水末次給藥24 h后，每日1次，末次給藥1 h后處死小鼠，浸入75%乙醇中約2 min，置于超凈工作臺中無菌開腹，取脾臟，放入盛有5 ml Hank液的平皿中清洗，除去血液。吸去Hank液，用砂面載玻片研磨，制成脾細胞混懸液。將制得的脾細胞混懸液1 500 r/min離心2次，添加紅細胞裂解液2 ml在37℃恒溫水浴靜置5 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清，Hank’s洗滌兩次，用10%的胎牛血清RPMI-1640培養液將脾細胞的細胞數調整成濃度為1×107/ml的細胞懸液，此細胞做為效應細胞，備用。將傳代培養的L929細胞在試驗前1 d換液，實驗時用0.25%的胰蛋白酶1 ml消化2 min，輕輕吹打細胞使其完全從壁上脫落，加入完全RPMI-1640培養液，終止消化，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，將沉積細胞重懸于含10%小牛血清RPMI-1640培養液中，調細胞濃度至2×105/ml，即備用的NK細胞的靶細胞。將準備好的靶細胞懸液加入96孔平底培養板中，0.1 ml/孔，然后放入5% CO2的37℃培養箱中培養1 h，使靶細胞貼壁成一單層細胞，向每孔加入0.1 ml效應細胞(使效靶比例為50∶1)，每樣品設4個復孔，靶細胞對照孔加入完全RPMI1640培養液 0.1 ml，放置于5% CO2的37℃培養箱培養20 h，傾去上清液，用37℃生理鹽水輕輕灌滿各孔，反復洗滌3次，以除去效應細胞及被殺死而脫落的靶細胞，在濾紙上吸干孔內水分，每孔加0.1 ml 0.1%的中性紅染液，5% CO2的37℃培養箱培養30 min，棄去染液，再用生理鹽水洗滌3次后，每孔加入0.1 ml細胞裂解液(50%醋酸和50%乙醇配制)，使吞噬中性紅的靶細胞溶解，釋放出中性紅，輕輕搖勻。在酶標儀波長570 nm處測定光密度(OD)值，并計算殺傷率，公式：殺傷率(%)=(靶細胞OD值-實驗組OD值)÷靶細胞OD值×100%。

1.7.4正常小鼠脾淋巴細胞增殖的測定 取ICR小鼠100只，組別與給藥劑量如表3所示，給藥組每日一次連續灌胃給藥90 d，末次給藥1 h后，處死動物。將小鼠于超凈工作臺無菌開腹，取脾臟放入盛有5 ml Hank液的平皿中清洗，去除血液，吸去Hank液，用帶有磨面的載玻片進行研磨，并用Hank液輕輕沖洗篩網，制成脾細胞懸液，2%臺盼藍試驗證實細胞存活率>95%。將制得的細胞懸液1 500 r/min離心，棄上清，添加紅細胞裂解液2 ml，在37℃水浴上靜置5 min，1 500 r/min離心，棄上清，用Hank液洗2次，用10%的胎牛血清RPMI-1640培養液將細胞數調成5×106/ml，接種至96孔細胞培養板，每孔180 μl，置于5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養4 h后，每孔加入刀豆素A(ConA)(終濃度5 μg/ml)或脂多糖(LPS)(終濃度10 μg/ml)各10 μl，繼續培養48 h，每孔加入濃度為5 mg/ml的噻唑藍(MTT)溶液10 μl，繼續培養4 h，輕輕吸去培養液后，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl，振蕩10 min，于酶標儀波長為570 nm處測定光密度(OD)值，計算增殖率，公式如下： 增殖率(%)=實驗組OD值÷對照組OD值×100%。

1.7.5正常小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子的測定 取ICR小鼠100只，按表3所示組別及劑量進行分組，給藥組每日1次連續灌胃給藥90 d，末次給藥后1 h處死小鼠，按上述“對正常小鼠淋巴細胞增殖反應的影響”中方法制備淋巴細胞，將制備好的淋巴細胞接種至96孔細胞培養板，每孔190 μl，置于5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養4 h后，每孔加入ConA(終濃度5 μg/ml)10 μl，繼續培養48 h，小心取上清，備用，采用ELISA方法測定上清液中的分泌細胞因子白細胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ的水平。

1.7.6正常小鼠血清IgG產生的測定 取ICR小鼠100只，按表3所示組別及劑量進行分組給藥組每日1次連續灌胃給藥90 d，實驗結束前7 d，腹腔注射20%綿羊紅細胞(SRBC)0.2 ml初次免疫，處死動物前再次注射20% SRBC 0.2 ml免疫小鼠。處死動物前禁食12 h，取血，制備血清，采用ELISA法檢測血清中IgG含量。

1.8統計學方法 應用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1對正常成年小鼠胸腺、脾臟重量及脾臟淋巴細胞增殖率的影響 與對照組比較，人參水提物大劑量組和人參醇提物中、大劑量組均可使正常成年小鼠胸腺、脾臟重量明顯增高(P<0.05)，人參原粉、人參水提物和人參醇提物各劑量組刺激下促進淋巴細胞增殖活性的趨勢。見表1。

2.2人參對各組小鼠吞噬率、吞噬指數及自然殺傷率的影響 與對照組比較，人參水提物大劑量組和人參醇提物大、中劑量組有增加吞噬率、吞噬指數及自然殺傷率的趨勢。見表2。

2.3人參對各組小鼠IL-2、 IFN-γ、IgG產生的影響 見表3。

表1 人參對正常成年小鼠胸腺、脾臟重量及脾臟淋巴細胞增殖率的影響

表2 人參對正常成年小鼠吞噬率、吞噬指數及自然殺傷率的影響

表3 人參對正常成年小鼠IL-2、 IFN-γ、IgG產生的影響

與對照組比較，人參水提物和人參醇提物大劑量組均可使正常成年小鼠IL-2、 IFN-γ(P<0.05)。人參原粉、人參水提物和人參醇提物各劑量組具有增加IgG含量的趨勢。

3 討 論

本實驗結果顯示，人參原粉及提取物具有增加正常成年小鼠胸腺、脾臟指數，增強腹腔巨噬細胞吞噬活性，提高自然殺傷細胞的殺傷率，促進脾淋巴細胞增殖、提高特異性抗SRBC抗體水平的趨勢；人參水煎煮提取物及人參乙醇提取物大劑量組，顯著增加正常成年小鼠胸腺、脾臟指數。水煎提取物、乙醇提取物大劑量組顯著增加正常成年小鼠脾淋巴細胞培養液上清中的細胞因子IL-2及INF-γ的含量；提示人參原粉及提取物可影響正常成年小鼠的非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫功能等，能提高機體免疫力，具有較好的免疫功能增強作用。

本實驗所用人參水提物含有人參總皂苷為0.99%，人參多糖為7.54%，而人參醇提物含人參總皂苷含量為2.33%，人參多糖為0.76%。實驗結果發現，人參水提物和醇提物均有提高免疫功能的作用或趨勢，提示人參提高免疫功能的作用可能與人參皂苷或人參多糖有關。

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