人溶菌酶cDNA克隆與CHO/dhfr-細(xì)胞中的分泌性表達(dá)

孫東業(yè) 張 濤 朱貴明 田黎明 張英海 杜靜平

(佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

溶菌酶可水解細(xì)菌胞壁的肽聚糖，從而使細(xì)菌溶解，并有激活補(bǔ)體和促吞噬、抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用，具有潛在的臨床價值〔1,2〕。溶菌酶廣泛存在于各種體液、外分泌液和吞噬細(xì)胞溶酶體中，而要大量獲得，基因工程是首選。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)水平高、操作簡單、周期短、成本低等優(yōu)點。但人溶菌酶(hLYZ)在原核中表達(dá)會引起宿主菌“自殺”性死亡，且翻譯后缺乏修飾，包涵體的復(fù)性操作復(fù)雜，獲得足量天然蛋白較困難〔3,4〕；而在酵母和霉菌中表達(dá)存在與大腸桿菌類似的問題〔5〕。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)盡管表達(dá)量可能欠缺，但可以實現(xiàn)真正的分泌表達(dá)，使產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)更接近，藥用更可靠〔6〕。本研究構(gòu)建真核可溶性表達(dá)載體pSecTag2/Hygro-hLYZ，利用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染技術(shù)在CHO/dhfr-細(xì)胞中表達(dá)，為工程化、規(guī)?；a(chǎn)hLYZ奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人胎盤組織由北京大學(xué)婦產(chǎn)兒童醫(yī)院手術(shù)室提供。CHO-K1/ dhfr-細(xì)胞系株及帶有 pSV2-DHFR質(zhì)粒的DH5α菌株：由中國科學(xué)院遺傳所徐玖瑾教授提供；分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroB及陽性對照質(zhì)粒PSA/Hygro購于invitrogen公司；pMD18-T vector載體、dNTP混合液、限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR V，T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司； DNA快速提取試劑盒、DNA片段膠回收試劑盒購自博大泰克； IPTG、X-Gal、核酸染料購自北京江晨生物技術(shù)公司；總RNA快速抽提純化試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2方法 從新鮮的人胎盤組織中分離提純總RNA，經(jīng)RT-PCR，用合成的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收產(chǎn)物用T4連接酶將其連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆。把連接在pMD18-T載體上的hLYZ cDNA片段用限制性內(nèi)切酶EcoR V和Xho Ⅰ雙酶切，再將回收的目的條帶連接到真核分泌性表達(dá)質(zhì)粒pSecTag2/HygroB上。經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，hLYZ因成功連接到表達(dá)載體上。利用脂質(zhì)體技術(shù),將含hLYZ基因的pSecTag2/HygroB-hLYZ 載體和pSV2/dhfr-2DNA 質(zhì)粒(3∶1)與脂質(zhì)體按4∶6比例轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-中。經(jīng)添加潮霉素B抗生素和氨甲蝶呤(MTX)并撤除H、T(次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷) 雙篩選下,獲得了24株陽性細(xì)胞克隆體。RT-PCR驗證hLYZ基因已整合入基因組中，并有其mRNA的轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)挑選一株擴(kuò)大培養(yǎng)并換用無血清培養(yǎng)基,在MTX加壓下擴(kuò)增DHFR 基因；隨DHFR共轉(zhuǎn)染的編碼hLYZ的基因序列也得到擴(kuò)增，進(jìn)而使目的蛋白表達(dá)量得到提高，收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液經(jīng)Ni+-Resin過柱純化。純化后的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚酰胺基凝膠(SDS-PAGE)和Western印跡鑒定。

2 結(jié) 果

2.1hLYZ cDNA的克隆

2.1.1hLYZ基因的克隆與鑒定 電泳顯示PCR擴(kuò)增獲得了特異性目的產(chǎn)物。 將電泳回收到的RT-PCR產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，白色菌落為重組轉(zhuǎn)化體。菌落PCR初步篩選鑒定后，再進(jìn)行酶切鑒定。用限制性內(nèi)切酶EcoR V和Xho I對重組轉(zhuǎn)化體進(jìn)行雙酶切鑒定與菌液PCR檢測結(jié)果一致，都產(chǎn)生同樣大小(434 bp)預(yù)期片段。初步篩選得到陽性克隆。見圖1A。將獲取的陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-hLYZ進(jìn)行測序，進(jìn)一步證實PCR結(jié)果。

2.1.2人溶菌酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建 pMD 18-T-HLYZ克隆質(zhì)粒與pSecTag2/Hygro真核表達(dá)載體分別用EcoR V和Xho I進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。接種于Amp/LB平板培養(yǎng)基，經(jīng)抗生素篩選挑取單個菌落于Amp/LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液PCR檢測為陽性后用博大泰克質(zhì)粒小量提取試劑盒提質(zhì)粒。質(zhì)粒用EcoR V、Xho I進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳R約430 bp的清晰單一條帶，初步判定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1B。

2.2人溶菌酶基因在CHO/dhfr-細(xì)胞中的分泌性表達(dá) 將構(gòu)建的人溶菌酶基因重組真核分泌性表達(dá)質(zhì)粒pSecTag2/HygroB-hLYZ與pSV2-DHFR質(zhì)粒利用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入CHO/dhfr中，潮霉素B篩選得到的陽性克隆經(jīng)MTX加壓擴(kuò)增，收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液經(jīng)Ni+-Resin過柱純化，純化蛋白液經(jīng)SDS-PAGE 和Western印跡鑒定結(jié)果，見圖1C、圖1D。

A：pMD18-T-hLYZ載體的菌落PCR及酶切鑒定分析，M：MakerⅢ 由上到下為4 500、3 000、2 000、1 200、800、500、200 bp，1: pMD18-T-hLYZ重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR V和Xho Ⅰ雙酶切，2： pMD18-T-hLYZ重組質(zhì)粒菌落PCR產(chǎn)物；B：pSecTag2/Hygro-hLYZ重組質(zhì)粒菌液PCR及酶切鑒定分析，M1: 1 kb DNA Ladder，由上到下依次為10、8、6、3.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、750、500、250 bp，M2: MakerⅢ，1：pSecTag2/HygroB質(zhì)粒EcoR V酶切，2: pSecTag2/Hygro-Hlyz(6F)重組質(zhì)粒EcoRV和Xho1雙酶切，3:菌液PCR產(chǎn)物hLYZ片段，4:菌液PCR空白對照(未加引物)；C：融合蛋白hLYZ-6×His在CHO/dhfr-細(xì)胞中的表達(dá)、純化后結(jié)果，M: SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker,由上到下依次為97、66.2、43、31、20.1、14.4 kD，1：Hygro-DHFR/CHO純化上清，2：LYZ-DHFR/CHO純化上清；D：Western印跡鑒定結(jié)果，M: SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker，1、2: LYZ-DHFR/CHO培養(yǎng)上清，3、4:Hygro-DHFR/CHO培養(yǎng)上清

圖1各實驗電泳結(jié)果

3 討 論

本實驗設(shè)計了人溶菌酶成熟蛋白130個氨基酸cDNA的特異引物及基因兩端與表達(dá)載體相對應(yīng)的酶切位點,考慮到融合表達(dá)蛋白融合片段對目的蛋白活性的影響，又在引物5'端加上腸激酶酶切位點序列，表達(dá)的融合蛋白純化后經(jīng)腸激酶作用，把N-和C-端多余序列切除，可使殘留氨基酸不影響HLYZ的空間結(jié)構(gòu)。另外在下游引物靠近酶切位點處增加了一個堿基，以保證插入片段下游氨基酸翻譯的讀碼正確。最終成功獲得了長度為390 bp目的片段，雖在105位置有變異(C→U)，但由于是密碼子的第三位堿基，GGU并不影響甘氨酸的翻譯，所得hLYZ一級結(jié)構(gòu)沒有變化，說明載體克隆成功。本實驗利用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染劑技術(shù)，在潮霉素最佳篩選濃度的作用下，獲得了24株抗性單克隆。為進(jìn)一步獲得高表達(dá)蛋白細(xì)胞株生產(chǎn)制備人用溶菌酶藥物做了上游技術(shù)水平的開發(fā)研究。

根據(jù)實驗結(jié)果，還將進(jìn)一步做些工作：①對篩選得到的陽性單細(xì)胞克隆要進(jìn)一步做蛋白的表達(dá)定量測定，篩選高表達(dá)蛋白細(xì)胞株；②對所得到的人溶菌酶融合蛋白進(jìn)行腸激酶酶切及生物活性的鑒定。

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