大鼠星形膠質細胞Toll樣受體表達譜

龔長銀 周愛玲

(南通大學醫學院病理生理學系，江蘇 南通 226001)

近年來有研究表明，星形膠質細胞(AS)可以通過其表面的受體，如高級糖化終產物受體、清道夫受體等〔1，2〕及其介導的信號轉導通路〔3〕而活化胞內信號轉導機制，從而誘導前炎性遞質等神經毒性物質的產生和釋放，導致阿爾茨海默病(AD)神經炎癥的發生〔4，5〕。然而，對AS Toll樣受體(TLRs)的表達譜及其在AD炎癥中的可能機制的研究未見諸多報道。TLRs是一種跨膜模式識別受體(PRRs)，能夠選擇性地識別侵入機體的病原微生物所攜帶的病原相關分子模式(PAMPs)，在病原識別、啟動和指導機體的免疫應答中發揮極其重要的作用〔6～8〕。本文旨在探討AS TLRs表達譜系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新生1～3 d SD大鼠，雌雄不限，由南通大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(蘇)2002-0022。

1.2主要試劑及儀器 DMEM/F12、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、胎牛血清(杭州四季青)、多聚賴氨酸(Sigma)、實時PCR試劑、TLRs引物(上海睿安生物科技有限公司，見表1)、瓊脂糖、Trizol(Invitrogen)、mouse anti-GFAP monoclonal antibody及Rabbit anti-TLR4 polyclonal antibody(Santa Cruz)、Hoechst 33342(Dojindo)。BS110S型電子天平(北京賽多利斯天平公司)、Microfuge 22R臺式冷凍離心機(Beckman)、-80℃超低溫冰箱(SANYO)、PHS-3C數字式酸度計(江蘇電分析儀器廠)、PTC-100 PCR儀(Bio-rad)、SX-300凝膠成像系統(上海四星生物技術有限公司)、小源凝膠圖像分析系統(上海小源科技有限公司)、移液器(Eppendorf)、IX51倒置熒光相差顯微鏡(SANYO)。

1.3AS的分離及培養(在無菌條件下操作) 取新生1～3 d的SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒5～10 min，用眼科剪斷頭，在無菌條件下用眼科剪小心剪開頭骨，剝離顱骨后小心取出雙側大腦皮層，置于盛有預冷D-Hank′s液中的培養皿中，輕輕地剝離腦膜和血管。然后，將大腦皮層移至另一個盛有預冷D-Hank′s液的培養皿中，如此洗2～3遍，以盡可能的去除腦膜和血管等。最后，將大腦皮層置于盛有DMEM/F12基礎培養基的培養皿中，用眼科剪將大腦皮層剪成糜狀，用巴斯德滴管轉移至離心管中，加入等體積的0.25%胰蛋白酶消化液(終濃度為0.125%)，37℃下消化10 min，每5分鐘晃動1次。然后，用含血清的培養基終止消化，輕輕吹打分散細胞，用不銹鋼濾網過濾，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入含血清的培養基，重新混懸沉淀成單細胞懸液，進行細胞計數。調整細胞濃度，按(1～2)×106/ml接種于未包被多聚賴氨酸的培養瓶中，于37℃、5% CO2培養箱中差速黏附處理30～60 min后，輕輕翻轉培養瓶，取細胞懸液接種于經多聚賴氨酸包被的培養瓶中繼續培養。每2～3天換液1次。培養9～14 d待細胞基本融合成單層并鋪滿瓶底后，進行消化傳代培養。

1.4AS的傳代純化 從培養箱中取出培養瓶，充分振蕩，用巴斯德吸管吸除培養液后，再用D-Hank′s液洗兩遍。用0.125%胰蛋白酶消化，并在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞變圓，大約有2/3的細胞漂浮在液體中時立即終止消化，防止消化過度而影響AS的活力。用吸管反復吹打培養瓶的底部，盡可能地將貼壁的細胞吹打下來。用培養基調整細胞密度，最后按照(1～2)×106/ml接種至預先經多聚賴氨酸處理的培養瓶中繼續培養。如此，待細胞傳至3～4代后，進行AS純度鑒定，達到要求后用于后續實驗。

表1 PCR引物序列

1.5AS純度鑒定 采用膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和Hoechst的免疫熒光雙標法，遵照實驗操作規程，對培養的AS進行純度鑒定，并用熒光顯微鏡觀察、攝片。

1.6實時PCR法測定AS的TLRs表達譜 按照Trizol試劑說明書，提取AS總RNA。并用Eppendorf核酸蛋白分析儀對其定量。選擇OD260/OD280在1.8～2.0的樣本進行實時PCR反應。根據試劑盒說明，在0.2 ml EP管中，取總RNA0.1～0.5 μg組成反應體系，于PCR儀進行擴增。RT參數：42℃，60 min 70℃，5 min 4℃保存。PCR參數：94℃，5 min(94℃，30 s 54℃，45 s 72℃，45 s)35個循環72℃，7 min 4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，電泳結束用凝膠成像系統拍攝并對結果進行分析。為了減少誤差，以TLRs與β-actin條帶密度之比表示TLRs的相對含量。

1.7免疫熒光雙標法測定TLR4在AS中的表達定位 依據說明書，對純化的AS進行TLR4和Hoechst免疫熒光染色，IX51倒置熒光相差顯微鏡下觀察定位。

2 結 果

2.1AS的形狀和狀態 原代培養24 h后開始貼壁生長，換液后繼續培養，細胞開始有細小的突起長出。隨著培養時間的延長，突出越來越多、越來越長，AS所占的比例越來越大。至9～10 d細胞聚集生長，胞體呈圓形或橢圓形，有較好的折光性，突起為兩極或三極，數量多，增殖旺盛。于倒置相差顯微鏡下觀察見大量AS鋪滿瓶底，并融合成單層。傳代后的AS生長更為活躍，一般7 d左右即可鋪滿瓶底，鏡下觀察細胞形態不規則，扁平狀相互融合成片，胞質豐富(圖1)。經鑒定，AS純度>95%(圖2)，滿足實驗要求。

圖1 大鼠皮層星形膠質細胞的形態(×200)

2.2AS TLRs表達譜 TLR1～11均有不同程度的表達，但不同的TLRs表達量不同，其中TLR4表達水平相對較高，與TLR1和TLR6相比，有統計學意義(P<0.05)。進一步實驗證明，TLR4表達定位于星形膠質細胞的胞膜和胞漿，是一種跨膜受體(圖3C、D、E)。因此，AS可能通過TLR4介導先天性或獲得性免疫反應參與AD的炎癥發病機制假說。

A：GFAP，AS胞質染成紅色； B：Hoechst33342，所有細胞核染成藍色； C：A和B的合并圖

A：TLR1～11的瓊脂糖凝膠電泳圖，1～11：TLR1～11，12：β-actin，M：marker;B:TLR1～11相對定量柱形圖，TLR4與TLR1和 TLR6相比：1)P<0.05； C：TLR4，AS胞膜和胞質染成綠色； D：Hoechst33342，所有細胞核染成藍色； E：C與D合并圖

3 討 論

AD的病理特征主要表現為老年斑(SP)、神經原纖維纏結(NFTs)和神經元丟失。AD的病因和發病機制十分復雜，迄今為止，尚未完全清楚。目前普遍認為，它是各種因素累積效應的結果〔9〕，例如年齡、基因突變和免疫反應等。因此，關于AD的發病機制也存在著多種學說，如Aβ學說、Tau蛋白過度磷酸化學說、炎癥和免疫學說等〔10〕。越來越多的證據表明，腦內存在的慢性炎癥反應與AD的發生發展有關，在AD的發病機制中發揮重要的作用〔11～13〕。因此，提出了AD發病機制的炎癥假說，包括炎癥細胞、炎癥因子和自由基等。而且，近來的研究〔14，15〕發現，用非甾體抗炎藥(NSAIDs)美洛昔康治療AD大鼠，可以減少腦組織內炎癥因子的水平及抑制環氧合酶-2(COX-2)的表達，從而延緩和抑制AD發病過程中的炎癥反應，降低AD的風險和延緩疾病的進展。

AS是中樞神經系統內分布最廣泛的膠質細胞，在腦內數量最多，是神經元數量的10倍左右〔16〕。近年來，越來越多的人們關注AS，其在神經退行性疾病發病機制中作用已成為研究的熱點。傳統觀點認為，AS為神經元提供結構及營養支持，是被動的次要角色。近年來研究表明，AS激活可合成和分泌許多炎癥因子和細胞因子，參與神經系統疾病的炎癥免疫反應〔17〕，在包括AD、帕金森病在內的神經退行性疾病發生和發展過程中起重要的作用〔18～22〕。

本研究將原代培養的AS經過多次傳代以后，一些神經元、血管內皮細胞、小膠質細胞及成纖維細胞等逐漸減少，最終AS占主要地位。本實驗中經傳代后的AS生長活躍，一般7 d左右即可鋪滿瓶底，鏡下觀察細胞形態不規則，扁平狀，相互融合成片，胞質豐富。GFAP是中樞神經系統中AS所獨有的細胞骨架蛋白，是公認的AS特征性標記物〔23～25〕。因此，本研究中采用GFAP鑒定培養的AS純度，結果表明，培養細胞經過3次傳代以后，AS純度達95%以上，滿足實驗的要求。

近年來發現的TLRs是一組新的模式識別受體(PRRs)，在很多病原微生物引起的感染性疾病和炎癥性損傷中的作用逐漸引起了人們的關注。TLRs表達于許多免疫和非免疫細胞，構成了先天性免疫的第一道防線。目前，有大量與膠質細胞相關的研究，對小膠質細胞的作用研究比較明確，小膠質細胞相當于中樞神經系統的單核巨噬細胞，表達TLR1～9〔26〕，由小膠質細胞激活介導的炎癥反應加劇了腦內神經元的死亡，而對AS激活的作用則不夠明確。

本實驗采用實時PCR方法和免疫熒光技術對AS TLRs的表達進行了研究，結果表明，正常情況下，AS不同程度地表達TLR1～11，其中TLR4表達水平相對較高，而且TLR4定位于AS的胞膜和胞漿，是一跨膜受體。為后續探討AS參與AD神經炎癥的可能分子機制提供了實驗基礎。

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