白芷生物堿對HeLa細(xì)胞的抑制作用

王建新 馬翠花

(秦皇島市第一醫(yī)院檢驗科，河北 秦皇島 066000)

多年來，國內(nèi)外學(xué)者對白芷進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有防曬、防紫外線及抑制酪氨酸酶作用〔1〕，因此開發(fā)出大量白芷產(chǎn)品如藥品、保健品、化妝美容品等〔2〕。最近，研究者又發(fā)現(xiàn)白芷具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)生長〔3〕、促進(jìn)倉鼠肺細(xì)胞增殖〔4〕和抗腫瘤作用，日本上原靖洋〔5〕研究表明，白芷果實甲醇提取物對腫瘤細(xì)胞(MK-1、B16F10、HeLa)增殖有抑制活性。白芷中主要成分為香豆素類和揮發(fā)油，此外還含有胡蘿卜苷、生物堿及鈣、銅、鐵、鋅、鎳、鎂等人體必需的微量元素〔6〕。目前研究多集中在白芷香豆素和揮發(fā)油上，而對白芷生物堿(AAD)對宮頸癌的作用，尚未見報道。本研究擬探討AAD對宮頸癌的抑制作用，為臨床開發(fā)新的有效的抗腫瘤中草藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1化學(xué)試劑盒細(xì)胞株 提取的白芷凍干粉用RPMI-1640培養(yǎng)基配制成儲存液備用。RPMI-1640(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hoechst 33342及碘化丙啶(PI)為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2細(xì)胞株 人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2方法

1.2.1藥物提取 將白芷粉末500 g用水浸泡12 h以上，超聲振蕩2 h左右，回收取水相，進(jìn)行第二次超聲，收取所有的水溶液；熱水器加熱到1 750 ml處，調(diào)pH為2～3，3 000 r/min離心10 min，取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮達(dá)到400 ml，25次萃取；pH值調(diào)至2～3，濃硫酸和正丁醇溶液進(jìn)行萃取，超聲波輔助萃取，終產(chǎn)物用濃NaOH將其pH值調(diào)至9～10，正丁醇萃取出生物堿，pH值保持在2～3之間；此時，生物堿易溶于酸液中，最終正丁醇蒸餾回收；調(diào)pH值7～7.5，中性偏堿，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，烘干，直到得到結(jié)晶物，即總生物堿(1 g)。

1.2.2生物堿鑒定 用高氯酸滴定法測定白芷中生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)99%以上。用酸性染料比色法測定，可分出與碘化鉀試劑呈色的雜志斑點，證明白芷中有關(guān)物質(zhì)主要為其有關(guān)生物堿。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及收集 將HeLa細(xì)胞單層接種在含10%小牛血清的RPMI-1640(含100 U/μl的青霉素和100 U/μl的鏈霉素)培養(yǎng)瓶內(nèi)，完全培養(yǎng)基按1×105的濃度接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。3 d傳代一次，所有實驗均在細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行。

1.2.4MTT測量HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(細(xì)胞數(shù)為每孔5×104個)培養(yǎng)12 h，加入不同濃度的AAD，使其終濃度為：100、200、400 μg/ml，每個濃度設(shè)四個平行復(fù)孔，陰性對照組為等體積RPMI-1640完全培養(yǎng)液，并設(shè)空白調(diào)零孔(只加完全培養(yǎng)液，不加細(xì)胞)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μl DMSO溶解，于酶標(biāo)儀492 nm處檢測，計算藥物的體外生長抑制率，用細(xì)胞生長抑制率對藥物作用時間繪制回歸曲線，求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組平均OD值-用藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

1.2.5熒光染色計算凋亡指數(shù)(AI) 取不同組別的對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，鏡下計數(shù)，調(diào)整濃度為5×105/ml，懸浮于1 ml培養(yǎng)基中，加入10 μl Hoechst 33342染液，混勻，37℃孵育5～15 min；細(xì)胞于4℃下500～1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1.0 ml Buffer A懸浮細(xì)胞和PI染液5 μl，避光混勻，熒光顯微鏡下觀察。Hoechst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長為352 nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光，PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488 nm，產(chǎn)生紅色熒光。藍(lán)綠色為凋亡細(xì)胞，紅色為壞死細(xì)胞。計數(shù)200個細(xì)胞，計算AI，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%〔7〕。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化 取對照和藥物(AAD 400 μg/ml)處理過的HeLa單細(xì)胞懸液(1×106ml)1 ml，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，然后加入預(yù)冷的1×Binding 緩沖液，再加入Annexin V-FITC液5 μl和PI液10 μl，混勻，室溫避光染色15 min。PBS洗2次，去除多余染料，流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm)。

2 結(jié) 果

2.1MTT測量結(jié)果 AAD對Hela細(xì)胞生長有明顯抑制作用，且隨著劑量的增高而增高，其藥物濃度與抑制率呈正性直線關(guān)系。見表1、圖1。

表1 AAD對HeLa細(xì)胞生長抑制作用

圖1 AAD對HeLa細(xì)胞生長抑制作用

2.2熒光染色計算AI AAD作用12 h后，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，24 h和48 h凋亡細(xì)胞增多，72 h凋亡細(xì)胞明顯增加，AAD誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡具有時間、劑量依賴性。不同濃度的AAD在不同作用時間，隨著濃度增加、時間增加，AI增加。見表2。

表2 AAD在不同的作用時間誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化(%)

2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化 細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，400 μg/mlAAD作用12 h，可見Hela細(xì)胞G2/M百分比增高為19.98%；作用36 h，G2/M百分比達(dá)32.45%，而未經(jīng)AAD作用的Hela細(xì)胞增殖正常，提示AAD通過抑制Hela細(xì)胞分裂而降低其增殖能力。見表3。

表3 AAD對HeLa細(xì)胞周期的影響(%)

3 討 論

化學(xué)抗癌藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡達(dá)到治療的目的。因此，細(xì)胞凋亡被視為評估療效的一項新指標(biāo)。如何誘導(dǎo)和調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡已成為目前抗腫瘤治療的研究熱點。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)生、器官發(fā)育及保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等正常生理過程起著十分關(guān)鍵的作用，并在調(diào)控細(xì)胞的增殖、腫瘤的發(fā)生和生長中起重要作用〔8～10〕。近年來的研究證明，細(xì)胞凋亡規(guī)律失常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。如果受損的細(xì)胞不能正確啟動凋亡機(jī)制，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞增殖與凋亡兩者間的平衡遭到破壞，使細(xì)胞過度增生，就有可能導(dǎo)致腫瘤。在目前的抗癌藥物中，無論是細(xì)胞周期特異性藥物，還是細(xì)胞周期非特意性藥物，對癌細(xì)胞的殺傷作用都服從一級動力學(xué)原理，即只能按比例而不能全部殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，尋求高效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物，在殺傷殘存癌細(xì)胞的同時又能避免對正常細(xì)胞的殺傷，具有非常重要的意義。中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡具有一定的可行性基礎(chǔ)〔11〕。本實驗將AAD(100～400 μg/ml)直接作用于HeLa細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)AAD不僅可明顯地抑制細(xì)胞生長，而且顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且作用強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)對濃度和時間的依賴性。因此認(rèn)為AAD是一個有廣泛應(yīng)用前景的抗癌新藥，其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療子宮癌的重要機(jī)制，為臨床使用提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

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