GnRH/EGFP轉基因對雌性大鼠黃體生成素分泌的影響

薛昊罡 蓋曉東 孫維琦 歷 春 齊明宇

(北華大學附屬醫院骨外科，吉林 吉林 132001)

青春期啟動是以促性腺激素釋放激素(GnRH)脈沖式規律性的釋放為標志，在大鼠中，下丘腦釋放GnRH與黃體生成素(LH)分泌至血漿有著重要的關系〔1,2〕，這表明LH的分泌是評價GnRH釋放的一個理想的指標。本文采用重復取靜脈血樣的方法來測定其LH的分泌水平。

1 材料與方法

1.1實驗動物 所有WISTAR-IMAMICH大鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為SCXK(滬)2010-008，所有試驗用鼠均在清潔級動物房飼養和繁殖，飼養條件為(27±1)℃，濕度70%±4%。每日自然光照，正常飲食喂養。

1.2試劑與材料 PMSG、HCG購自浙江寧波激素制品廠；M16、M2、透明質酸酶及礦物油為美國sigma公司產品；0.9%生理鹽水、75%酒精均自行配制。

1.3方法

1.3.1通過對WISTAR-IMAMICH大鼠受精卵進行顯微注射和胚胎移植方法建立GnRH/EGFP轉基因大鼠 ①顯微操作和胚胎移植：將優質單細胞受精胚胎按每批30～40枚置于Olympus倒置顯微鏡下進行雄原核顯微注射。為最大限度確保所得試驗數據的一致性，排除注射針的影響，整個試驗中使用的是同一批次制備的規格基本一致的注射針，并用IM-300自動注射儀控制相同的注射壓力和劑量。注射后胚胎轉入新鮮的M16培養滴中，在37℃、5%CO2培養箱中培養60 min。培養后倒置顯微鏡下檢查和記錄胚胎存活數。以具有完整卵胞質膜、正常卵周隙判斷為存活，胞質擴散、卵周隙消失的則為死亡胚胎〔3〕。②胚胎移植：存活的單細胞胚胎經輸卵管移植到同期發情的假孕受體WISTAR-IMAMICH大鼠體內，雙側移植，每側8～12枚。移植后19～22 d記錄產子數〔4〕。③首建大鼠PCR整合檢測：抽提仔鼠尾組織DNA，并根據顯微注射序列設計一對特異性引物，上游5′-CGCTCGAGTTCCTTCACAGTAAAGGG-3′；下游：5′-CGGGATCCTCTGGGACACTGAAGTCT-3′。

1.3.2分組 選擇8～13月齡的GnRH/EGFP轉基因雌性大鼠，選擇相同月齡WISTAR-IMAMICH雌性大鼠作為對照組，其中GnRH/EGFP轉基因雌性大鼠8只，平均月齡(11.7±0.60)個月；WISTAR-IMAMICH雌性大鼠6只，平均月齡(12.1 ±0.24)個月；選擇8～13月齡的GnRH/EGFP轉基因雄性大鼠14只，平均月齡(10.6±0.8)個月，選擇相同月齡WISTAR-IMAMICH雄性大鼠7只作為對照組，平均月齡(11.2±0.16)個月。GnRH/EGFP轉基因雌性大鼠及其對照WISTAR-IMAMICH大鼠在(1.8±0.20)或(1.9±0.30)月齡行卵巢切除；而GnRH/EGFP轉基因雄性大鼠及其對照WISTAR-IMAMICH大鼠在(2.0±0.58) 或(2.6±0.60)月齡進行閹割。

1.3.3樣品收集 在大鼠右心房頸靜脈表面插入導管3～5 d后，于8∶00～12∶00收集血樣1 ml，0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180 min各取樣1 ml，血標本保存于-20℃冰箱備檢。

1.3.4雌二醇誘導的GnRH峰評價 卵巢切除4 d后，大鼠皮下注射1 μg苯甲酸雌二醇；7 d后，再給予鹽酸苯丙烯啶以誘導LH峰。

1.3.5交配誘導GnRH峰評價 經卵巢切除12 d后，雌性轉基因大鼠(9∶00)皮下注射2 μg苯甲酸雌二醇，14 d后注射苯甲酸雌二醇500 μg(9∶00)。4 h后，將雌性大鼠與已證實的種公合籠進行2 h的交配實驗，并作為未交配對照。實驗結束后迅速將實驗動物進行安樂死，并保留其軀干、血液和大腦。

1.3.6LH測定 血清LH水平用雙抗體RIA測定，每個血標本均進行2管測定，取其平均值。

1.3.7c-fos免疫組化 雌二醇誘導組與交配誘導組大鼠的下丘腦切開，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，用于光鏡及免疫組化研究。

2 結 果

2.1脈沖式LH變化情況 由圖1和圖2可知非轉基因對照大鼠的脈沖式LH分泌較轉基因雌性大鼠的LH分泌更明顯。經統計發現兩組大鼠的平均LH濃度和LH脈沖幅度無明顯差異，但是轉基因雌性大鼠的LH脈沖頻率明顯低于雌性對照組大鼠(P<0.05)。這種差異在圖中主要體現在轉基因雌性大鼠中僅出現一次脈沖，而對照組WISTAR-IMAMICH雌性大鼠的脈沖次數則達到了3～5次，平均(4.1±0.5)次。

LH脈沖同樣也在閹割的雄性轉基因和非轉基因大鼠中出現(圖3、圖4)。所有的雄性大鼠在3個小時的取樣監測中出現了至少2次的LH脈沖(2～6次脈沖)，其中轉基因雄性大鼠平均LH脈沖為(2.8±0.7)次，而對照組雄性大鼠的平均LH脈沖次數則達到了(2.3±0.9)，兩組雄性大鼠的LH濃度、LH脈沖幅度及LH脈沖頻率均無明顯差異(P>0.05)。

圖1 GnRH/EGFP轉基因雌性大鼠經卵巢切除后的LH分泌情況

圖2 非轉基因WISTAR-IMAMICH雌性大鼠經卵巢切除后的LH分泌情況

圖3 GnRH/EGFP轉基因雄性大鼠閹割后的LH分泌情況

圖4 非轉基因WISTAR-IMAMICH雄性大鼠閹割后的LH分泌情況

圖5 腦組織神經元熒光金和EGFP標記

2.2腦組織神經元熒光金和EGFP標記 采用熒光金(FG)逆行追蹤法觀察5只雌性大鼠的1 208個GnRH神經元、4只雄性大鼠的1 310個GnRH神經元，見圖5。經統計，每只雌性大鼠中被熒光金標記的神經元達(112±36)個，檢測率為(41.9±5.7)%；雄性大鼠達(99±20)個，檢測率為(38±7.2)%。

2.3雌二醇、交配誘導的GnRH分泌變化 在轉基因雌性大鼠中雌二醇誘導LH分泌隨時間的變化情況，其中12∶00的LH濃度較低〔(1.41±0.32)ng/ml〕，第一次明顯增加是在16∶00〔(6.82±0.72)ng/ml〕，直至22∶00 LH水平仍然處于較高水平〔(6.47±0.68)ng/ml〕，其中19∶50的LH水平最高〔(13.76±1.35)ng/ml〕。在轉基因雌性大鼠中雌二醇誘導激活了70%的GnRH神經元。

在轉基因雌性大鼠中交配誘導的LH分泌水平明顯高于未交配的雌性WISTAR-IMAMICH大鼠〔(1.36±0.42)ng/ml〕。發生交配的雌性大鼠的60%GnRH神經元被激活。

3 討 論

目前的研究結果顯示GnRH/EGFP轉基因雌性大鼠的陣發性GnRH分泌的脈沖頻率明顯下降(僅1次)，而正常對照雌性大鼠的脈沖頻率則與文獻報道一致〔5,6〕。本研究中轉基因雌性大鼠的下丘腦組織中標記上熒光金的EGFP-GnRH神經元比例與文獻中所報道的轉基因和非轉基因大鼠相一致〔7,8〕，并且與轉基因雄性大鼠也相接近。鑒于在去勢大鼠中觀察到的GnRH與LH分泌之間的關系〔1,2〕，本研究說明GnRH/EGFP轉基因雌性大鼠GnRH神經元GnRH分泌水平下降。

在本研究中，激素誘導和交配誘導均可引起GnRH峰。這說明脈沖頻率的減少并不能反映雌性大鼠的激素分泌對其整體的影響。在引起GnRH峰期間，c-fos在含有EGFP的GnRH神經元中的表達與下丘腦對激素和交配刺激引起的GnRH峰是一致的。綜合起來看，雖然卵巢切除大鼠的激素分泌下降，但是表達有EGFP的GnRH神經元卻可以發生交配誘導的神經內分泌反射。在這方面，最近有文獻報道即使相對較少的GnRH神經元仍可以支持其GnRH分泌功能〔9〕。轉基因雌性大鼠在內源激素刺激、外源激素治療及交配等三種狀況下會發生強烈的激素激增。

引起轉基因雌性大鼠LH搏動下降的原因目前尚未清楚。本研究中雄性大鼠正常的間斷性激素分泌可能本質上并非是由于EGFP在神經元中的表達，這可能是多種內部和外部因素共同作用的結果，其中一些內部或外部因素可能是調節激素搏動性分泌的主要因素。最近的相關研究表明〔10〕GnRH-EGFP轉基因雌性大鼠的GnRH神經元的受體表達較復雜。而這些受體可能在雌性大鼠激素搏動性分泌中起著重要的作用。另外，GnRH神經元需要整合到多種內部或外部因素影響的下丘腦回路中(雌、雄各不相同)。據文獻證實GnRH神經元的分布較為廣泛〔11〕，轉基因和非轉基因大鼠的單個GnRH神經元的高斯分布情況比較類似。但是，在下丘腦上解剖定位GnRH神經元中起到生殖調節作用的準確位置卻很難。

4 參考文獻

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3Xue HG, Yamamoto N, Kato M,etal. Morphological characteristics of gonadotropin releasing hormone (GnRH) neurons in the preoptic area of GnRH-EGFP transgenic rat 〔J〕. Neurosci Res(Suppl), 2007;58:221.

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8Silverman AJ, Witkin JW, Silverman RC,etal. Modulation of gonadotropin-releasing hormone by uptake of fluorogold from the vasculature 〔J〕.Synapse, 1990;6:154-60.

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11Silverman AJ, Livine I, Witkin JW. The gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry and in situ hybridization. In: Knobil E, Neill JD, eds.The physiology of reproduction〔M〕.New York: Raven, 1993:1683-709.