天麻素在鐵誘導(dǎo)的大鼠離體心肌損傷中的保護(hù)作用

馬會浩 周 敏 何白云 陳歡俊 劉 惠 張永星 汪博泉

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

近年研究發(fā)現(xiàn)：天麻素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗癲癇，改善腦血流量不足；能抑制心肌細(xì)胞生物膜的脂質(zhì)過氧化作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝，對心肌缺血再灌注(I/R)的損傷有顯著的保護(hù)作用〔1〕。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，心肌缺血后心肌細(xì)胞內(nèi)鐵含量急劇增加，約為正常時的27倍，為I/R損傷的主要原因之一〔2〕。本實(shí)驗(yàn)探討天麻素在鐵誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和試劑 雄性SD大鼠(250～300 g)由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔編號：SCXK(鄂)2011-0012〕。天麻素購于中國藥品生物制品鑒定局；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)均購于南京建成生物工程研究所；FeCl3·6H2O和8-羥基喹啉(8-HQ)均購于Sigma公司；其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。使用前，將FeCl3·6H2O和8-HQ按1∶2的比例混合，形成脂溶性復(fù)合物Fe-HQ。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 8道多功能生理記錄儀(BLOPAC Systems MP150)生物信號采集系統(tǒng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組8只大鼠，每只大鼠總計(jì)灌流時間為90 min。各組心臟用K-H液灌流30 min平衡后，再分別進(jìn)行如下操作：正常組，繼續(xù)灌流K-H液60 min；Fe-HQ組，持續(xù)灌流K-H液30 min，再灌Fe-HQ(5 μmol/L)10 min，復(fù)灌K-H液20 min；天麻素(0.1 mmol/L)組，天麻素(0.1 mmol/L)灌流30 min，再灌Fe-HQ(5 μmol/L)10 min,復(fù)灌K-H液20 min；天麻素(0.025 mmol/L)組，天麻素(0.025 mmol/L)灌流30 min，再灌Fe-HQ(5 μmol/L)10 min,復(fù)灌K-H液20 min。

1.4Langendorff灌流大鼠離體心臟和心功能指標(biāo)的測定 雄性SD大鼠麻醉后，迅速取出心臟置于4℃ Krebs-Henseleit溶液(K-H液)中，剪去周圍多余結(jié)締組織，固定在Langendorff灌流裝置上，恒溫(37.0℃)恒壓(90 cmH2O)灌流。K-H液成分：118 mmol/L氯化鈉(NaCl), 4.7 mmol/L氯化鉀(KCl),2.5 mmol/L CaCl2,1.2 mmol/L硫酸鎂(MgSO4),1.2 mmol/L(KH2PO4),11 mmol/L葡萄糖(Glu),25 mmol/L碳酸氫鈉(NaHCO3),pH 7.35～7.45，持續(xù)通入混合氣體〔95%氧(O2)和5%二氧化碳(CO2)〕。采用左室內(nèi)水囊傳遞壓力測定心室內(nèi)壓，觀察和記錄心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)、dp/dt max和冠脈流量(CF)各項(xiàng)心功能指標(biāo)。

1.5心肌損傷和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定 待大鼠心功能穩(wěn)定后，每5 min測量1次CF，并用試劑盒測定最后一次的冠脈流出液中的LDH和CK的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測定心室肌組織中的MDA濃度。

1.6心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取心肌組織(厚約3 mm)，經(jīng)戊二醛固定，用以電鏡切片。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1天麻素對鐵誘導(dǎo)的大鼠心功能的影響 Fe-HQ組：HR、dp/dt max、CF均明顯降低，復(fù)灌K-H液后不能恢復(fù)；LVSP在灌Fe-HQ時有明顯的降低，復(fù)灌5 min時快速反轉(zhuǎn)至接近正常水平再迅速下降。天麻素(0.1、0.025 mmol/L)組對鐵誘導(dǎo)的心肌的HR、LVSP、dp/dt max、CF的下降均有抑制作用，且K-H液復(fù)灌后保持穩(wěn)定。見圖1。

與Fe-HQ組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

2.2天麻素對鐵誘導(dǎo)的大鼠離體心臟的LDH、CK和MDA的影響 Fe-HQ組，冠脈流出液中的LDH和CK的含量及MDA的濃度，較正常組、天麻素(0.1、0.025 mmol/L)組顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.3對心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 Fe-HQ組心肌肌纖維疏松，線粒體腫脹，嵴減少，甚至出現(xiàn)空泡和部分線粒體崩解。而天麻素(0.1、0.025 mmol/L)組的肌膜平直、均勻、完整，心肌肌絲排列有序整齊，肌節(jié)界限清楚，Z線、M線、I帶、A帶、H帶清晰可見，線粒體嵴致密，清晰。在電鏡40萬倍下觀察，天麻素0.1 mmol/L組較0.025 mmol/L組的心肌組織整體狀態(tài)更好。見圖2。

表1 天麻素對鐵誘導(dǎo)的大鼠離體心臟的LDH和CK的含量及MDA的濃度的影響

圖2 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu) (×200 000)

3 討 論

Fe-HQ可促進(jìn)Fe3+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入心肌細(xì)胞內(nèi)，并阻止鐵重新轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，從而增加了心肌細(xì)胞內(nèi)的Fe3+的濃度。而單純的8-HQ對心臟的各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯的改變〔3〕。因此可以用Fe-HQ灌流心臟制備鐵誘導(dǎo)心肌損傷模型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)e-HQ能顯著降低HR、dp/dt max、CF，復(fù)灌K-H液后，不能恢復(fù)，與文獻(xiàn)報(bào)道相似〔4〕。Fe-HQ灌流引起心肌細(xì)胞內(nèi)Fe3+濃度顯著提高，對心肌有毒性作用，造成心肌收縮功能的降低，這種病理改變主要有：Fe3+攻擊心肌細(xì)胞，與富含巰基的蛋白質(zhì)作用〔5〕，造成細(xì)胞內(nèi)與收縮相關(guān)的酶失活，致使心肌電及收縮功能的異常〔4〕；同時鐵抑制肌漿網(wǎng)RYR受體的結(jié)合性，導(dǎo)致外鈣內(nèi)流誘發(fā)的內(nèi)鈣釋放的減少〔6〕；因內(nèi)鈣釋放的減少導(dǎo)致心肌收縮能力的降低。本研究結(jié)果提示天麻素對鐵誘導(dǎo)的大鼠離體心臟功能損傷有保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度的Fe3+能使灌流液中的·OH含量增高〔7〕；Fe3+-HQ易被細(xì)胞內(nèi)的還原物質(zhì)所還原，而在有氧情況下，F(xiàn)e2+-HQ可被快速氧化〔8〕；因此Fe-HQ在心肌細(xì)胞內(nèi)易發(fā)生還原氧化反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基，對心肌產(chǎn)生毒性作用。心肌組織中的MDA含量間接反映了組織中氧自由基的變化，反映心肌組織脂質(zhì)過氧化程度。冠脈流出液中，心肌損傷的標(biāo)志性酶LDH和CK的釋放量也能反映心肌的損傷程度。天麻素預(yù)灌后，能有效改善Fe-HQ灌流引起的心肌脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果提示天麻素可能是通過減輕生物膜的脂質(zhì)過氧化作用，拮抗Fe-HQ的脂質(zhì)過氧化損傷，對心肌起保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

1周 敏,陸永利,鄭世玲,等.天麻素抗離體心肌缺血/再灌注損傷的作用〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009;12(12):80-2.

2Voogd A,Sluiter W,van Eijk HG,etal. Low molecular weight iron and the oxygen paradox in isolated rat hearts〔J〕. J Clin Invest,1992;90:2050-5.

3陳瑩瑩,夏 強(qiáng),曹春梅,等.一氧化氮在鐵誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷中的作用〔J〕.生理學(xué)報(bào),2002;54(4):300-6.

4陳瑩瑩,曹春梅,徐萬紅,等.鐵負(fù)荷對離體大鼠心臟和分離心室肌細(xì)胞的作用〔J〕.中國病理生理雜志,2002;18(8):985-7.

5Korge P,Campbell KB. Iron effects on myocardial enzymes depend on redox state〔J〕. J Mol Cell Cardiol,1994;26(2):151-62.

6Kim E，Ciri SN，Pessah IN. Iron(Ⅱ) is modulator of ryanodine-sensitive calcium channels of cardiac muscle sarcoplasmic reticulum〔J〕. Toxicol Appl Pharmacol,1995;130:57-66.

7Oubidar M,Marie C,Mossiat C,etal. Effects of increasing intracellular reactive iron level on cardiac function and oxidative injury in the isolated rat heart〔J〕. J Mol Cell Cardiol,1996;28(8):1769-76.

8Oubidar M,Boquillon M,Marie C,etal. Effect of intracellular iron loading on lipid peroxidation of brain slices〔J〕. Free Radic Biol Med,1996;21:763-9.