姜黃素通過激活AMPK抑制人肝癌細胞HL-7702的增殖

田 杰 李慧萍 任配友 劉春禹 李 銳

(長春醫學高等?？茖W校，吉林 長春 130031)

姜黃素是姜科姜黃根莖中發現的一種酚性色素，研究表明，姜黃素能夠預防多種疾病，如糖尿病，肥胖，癌癥等，尤其作為一種具有良好發展前景的抗癌新藥，具有抗癌譜廣、毒副作用小的優點，可抑制多種體外建株腫瘤細胞的生長〔1〕，其作為化學預防藥物的研究已進入臨床試驗階段〔2,3〕。在肝癌的研究方面，姜黃素對HL-7702人肝癌細胞增殖的影響尚未見報道。本實驗通過研究姜黃素對HL-7702增殖的影響明確姜黃素的抗肝癌能力，并通過觀察其對AMP蛋白激酶(AMPK)的激活作用初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 姜黃素購于美國Sigma公司；HL-7702人肝癌細胞購于ATCC；RPMI-1640培養液、胎牛血清購于Hyclon公司；AMPK激活劑(AICAR)、AMPK抑制劑(compound C)購自美國Selleckchem公司；抗體購自美國Abcam公司。

1.2腫瘤細胞的培養與傳代 HL-7702人肝癌細胞于含10%胎牛血清(BAS)的RPMI1640培養液中，于37℃、5% CO2孵箱中培養，采用0.25%胰酶消化傳代。

1.3噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況 取對數生長期的HL-7702細胞，消化，計數，用含10%BSA的 RPMI1640 培養液配制成 1×105個/ml 的細胞懸液，充分吹打后接種于 96 孔板中，100 μl/孔。 將培養板置于培養箱中培養。次日加藥處理，繼續培養48 h后，吸去培養基，換無血清的 RPMI1640，并加入MTT10 μl，繼續培養4 h。小心吸棄培養上清液，每孔加入150 μl二甲基亞礬(DMSO)，震蕩混勻10 min 后，酶標儀上490 nm處測定各孔的吸光度A值。 按下列公式計算：細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.3.1檢測姜黃素對細胞增殖的影響 接種于96孔板的細胞，次日貼壁后分別更換含姜黃素的培養液至姜黃素終濃度為0、50和100 μmol/L，每個濃度設 5 個復孔。加藥48 h后以0 μmol/L姜黃素的增殖率為100%，檢測50和100 μmol/L姜黃素劑量組的細胞增殖抑制率。

1.3.2檢測姜黃素與AICAR聯合應用對細胞增殖的影響 細胞接種的次日，分別加入含0、50、100 μmol/L姜黃素，0.125 mmol/L AICAR，50 μmol/L姜黃素聯合AICAR，100 μmol/L姜黃素聯合AICAR。加藥48 h后以0 μmol/L姜黃素的增殖率為100%，檢測50、100 μmol/L姜黃素及聯合用藥組的細胞增殖抑制率。

1.3.3檢測姜黃素與compound C聯合應用對細胞增殖的影響 細胞接種的次日，分別加入含0、50、100 μmol/L姜黃素，0.005 mmol/L compound C，50 μmol/L姜黃素聯合compound C，100 μmol/L姜黃素聯合compound C。加藥48 h后以0 μmol/L姜黃素的增殖率為100%，檢測50、100 μmol/L姜黃素及聯合用藥組的細胞增殖抑制率。

1.4Western印跡方法檢測姜黃素對HL-7702細胞AMPK表達及活化的影響 HL-7702細胞分別用0、50、100 μmol/L濃度姜黃素處理48 h后，用磷酸鹽緩沖劑(PBS)洗3次，用蛋白刮將細胞刮下，超聲裂解細胞，離心，取上清蛋白溶液，蛋白定量后取40 μg蛋白加入5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，12% SDS-PAGE電泳分離，100 V轉膜1.5 h，用3% BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉，TBST洗膜，依次加入一抗、二抗進行免疫結合，AP顯色。以β-actin為內參照，計算相對光密度(A)值。目的蛋白的相對光密度值=(目的蛋白條帶光強度×平均光密度)/(同一樣品β-actin條帶光強度×平均光密度)。實驗重復3次，計算各組光密度A值的均值與標準差。以目的蛋白的相對光密度(A)值間接表示蛋白含量。A越大，蛋白含量越高。

2 結 果

2.1姜黃素對HL-7702增殖的影響 結果顯示，與0 μmol/L劑量組相比，50 μmol/L和100 μmol/L姜黃素劑量組細胞增殖明顯受到抑制，抑制率分別為83.5%±3.1%和90.5%±3.6%(P<0.001)。

2.2姜黃素對HL-7702中AMPK表達及活化的影響 與0 μmol/L劑量組相比，50 μmol/L和100 μmol/L姜黃素劑量組細胞中AMPK及磷酸化AMPK的含量顯著增高。見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素處理后HL-7702細胞中AMPK的表達與活化

2.3姜黃素與AICAR聯合應用對細胞增殖的影響 與0 μmol/L劑量組相比，單獨應用AICAR組細胞的增殖抑制率為23.6%±6.3%(P<0.05)，與50 μmol/L和100 μmol/L劑量組相比，姜黃素與AICAR聯合應用對細胞增殖的抑制率無明顯改變(P>0.05)。

2.4姜黃素與compound C聯合應用對細胞增殖的影響 與0 μmol/L劑量組相比，單獨應用compound C組細胞的增殖情況無明顯改變(P>0.05)；與50 μmol/L和100 μmol/L劑量組相比，姜黃素與compound C聯合應用時，細胞的增殖抑制率分別下降至77.6%±4.9%(P<0.001)和81.1%±3.4%(P<0.01)。

2.5姜黃素與AICAR和compound C聯合應用對細胞增殖的影響 與單獨使用姜黃素組，以及姜黃素與AICAR聯合應用組相比，姜黃素與AICAR和compound C聯合應用時，細胞的增殖情況無明顯改變；與姜黃素聯合compound C組相比，姜黃素與AICAR和compound C聯合應用后，HL-7702細胞的抑制率分別上升為84.1%±5.1%(P<0.001)和90.9%±3.6%(P<0.01)。

3 討 論

姜黃素是從姜科、天南星科一類植物的根莖中提取的天然食用色素，研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗血管生成以及抗炎等作用〔4〕，對許多疾病還具有預防作用〔5〕，其因價格低廉、藥理作用廣泛和潛在的抗腫瘤作用而備受關注。本實驗結果顯示姜黃素可抑制HL-7702人肝癌細胞的增殖，且抑制程度具有濃度依賴性。

Western印跡結果顯示，姜黃素作用后HL-7702細胞中AMPK與p-AMPK均上調，提示姜黃素可能通過激活AMPK從而抑制HL-7702細胞增殖。AMPK是一種高度保守的能量敏感的絲/蘇氨酸激酶，其活性受 AMP/ATP 比例調節〔6〕。AMPK作為“能量感受器”在糖調節及脂類代謝如脂肪酸氧化、脂肪形成、蛋白質與膽固醇形成中發揮關鍵作用。研究發現，腫瘤細胞及其周圍細胞中AMPK活性降低并伴隨以上生理過程發生重要改變〔7，8〕。研究證明，AMPK在細胞程序性死亡及細胞凋亡中發揮重要作用〔9，10〕，因此AMPK成為腫瘤預防和治療的新靶點〔11〕。

本實驗結果顯示姜黃素與AICAR聯合使用對HL-7702增殖的抑制作用與單一使用姜黃素處理組相比無明顯差異，可能是由于姜黃素已使AMPK充分激活，聯合應用AICAR后，AMPK并未得到進一步的激活。而將不同濃度姜黃素聯合AMPK抑制劑compound C處理HL-7702細胞后，聯合組對HL-7702細胞增殖的抑制作用較單一姜黃素處理組減弱，提示姜黃素聯合compound C時，compound C部分抵消了姜黃素對AMPK的激活作用，故對HL-7702細胞增殖的抑制作用減弱。而三者聯合應用時，AICAR與compound C對AMPK的激活和抑制作用相互抵消，進一步證明姜黃素對HL-7702細胞增殖的抑制作用與激活AMPK有關。

4 參考文獻

1趙毅輝，李德俊，王順金. 姜黃素對SMMC-7721人肝癌細胞凋亡和細胞周期的影響 〔J〕. 實驗與檢驗醫學, 2010;28(2):130-3.

2Goel A, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. Curcumin as “Curecumin” from kitchen to clinic〔J〕. Biochemi Pharmacol, 2008;75(4):787- 809.

3Anand P, Sundaram C, Jhurani S,etal. Curcumin and cancer: an "old-age" disease with an “age-old” solution〔J〕. Cancer Lett, 2008;267(1):133-64.

4Shieh JM, Chen YC, Lin YC,etal. Demethoxycurcumin inhibits energy metabolic and oncogenic signaling pathways through AMPK activation in triple-negative breast cancer cells〔J〕. J Agric Food Chem,2013;61(26):6366-75.

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