腦源性神經營養因子基因功能性多態rs6265與散發性阿爾茨海默病的相關性

李家鑫 韋斌垣 歐俐羽 李 劍

(廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，廣西 南寧 530021)

腦源性神經營養因子(BDNF)基因與阿爾茨海默病(AD)的關系，已經引起人們的重視。BDNF能夠支持前腦、海馬及皮質膽堿能神經元的生存、分化和修復，并且在突觸可塑性中發揮了重要的作用，因此與學習和記憶有著密切的聯系。已有研究表明BDNF參與了AD的發病〔1〕，并有可能成為治療AD的手段〔2〕。本文將從BDNF基因的功能性多態(rs6265)層面來探討BDNF與散發性阿爾茨海默病(SAD)的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取自2010年1月至2011年3月在廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科和江濱醫院神經內科住院的SAD患者58例，其中男性40例，女18例，年齡57～76〔平均(66.66±11.82)〕歲，病程1～16年，平均發病年齡(63.03±7.24)歲,平均病程(6.62±4.565) 年。所有患者均進行了臨床檢查、簡易智能狀態檢查(MMSE)和Hachinski缺血評分，并經過至少二名神經科專家診斷，均符合NINCDS-ADRDA“很可能AD”診斷標準〔3〕。排除外患嚴重軀體疾病、有抑郁癥狀和癡呆家族史者。對照組為同期52例在我院行體檢的健康老年人，其中男33例，女19例，年齡56～74〔平均(63.75±9.14)〕歲。兩組在年齡(U=0.953 2，P=0.339 8)和性別構成上(χ2=0.372 1，P=0.541 2)均無差異。均簽署知情同意書。

1.2主要材料 MJ PTC-220 PCR儀;紫外光凝膠電泳成像分析系統；血液基因提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),2×TaqPCRMasterMix (北京康為世紀生物科技有限公司),瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司),Gene finder核酸染料(Takara公司)，5×TBE〔生工生物工程(上海)有限公司〕，DNA marker(600 bp)(廣州東盛生物科技有限公司)，Eco72Ⅰ快速酶(Thermo公司)；人腦源性神經營養因子(BDNF)快速檢測試劑盒(CUSABIO，CSB-E04501h)，Bio-RAD Imark酶標儀。

1.3血樣采集 所有患者均空腹采取靜脈血5 ml，將其中的2 ml沿管壁緩慢注入含肝素抗凝管中,立即于-70 ℃冷凍存放以行基因檢測；余下的緩慢注入非抗凝管中，室溫放置60 min后以1 000 r/min離心20 min，取血清分裝于EP管中，置-70 ℃低溫冰箱保存，以檢測BDNF。

1.4基因檢測 使用血液DNA提取試劑盒(離心柱型)提取血液DNA。BDNF基因G196A上游引物：5′-AAGAAGCAAACATCCGAGGACA-3′,下游引物：5′-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3′,引物由深圳華大基因科技有限公司合成。然后應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術擴增目的DNA片段并進行基因分型。PCR擴增循環條件：94℃起始5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環反應35次，72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經Eco72Ⅰ快速酶切，酶切產物即刻進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外光凝膠電泳成像分析系統上進行掃描、拍照，并進行圖像分析，對BDNF G196A進行基因分型。

1.5BDNF的檢測 采用人BDNF ELISA試劑盒測定，按說明書操作，最后用酶標儀讀數，取單波長450 nm，用空白孔調零，然后測定各孔光密度(OD值)。用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數2，即為樣品的實際濃度。

1.6統計學分析 用SPSS13.0統計軟件，樣本均數比較采用t檢驗，構成比比較采用χ2檢驗；基因型頻率和基因頻率采用基因計數法，吻合度檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡。

2 結 果

2.1BDNF多態性位點分析 BDNF G196A位點PCR產物的酶切電泳結果 PCR產物長度為500 bp，當等位基因為G時，PCR產物經Eco72Ⅰ酶切后形成131和369 bp片段，在凝膠電泳圖上顯示2條電泳帶；當等位基因為A時PCR產物不能被Eco72Ⅰ酶切，片段長度為500 bp，在凝膠電泳圖上顯示1條電泳帶；當等位基因為雜合型A/G時，在凝膠電泳圖上顯示3條電泳帶，見圖1。

2.2BDNF Val 66 Met多態性檢測

2.2.1Hardy-Weinberg 吻合度檢驗 兩組3種基因型觀察值與期望值檢測符合Hardy-Weinberg平衡定律(SAD組χ2=0.064，P=0.800；對照組χ2=0.076，P=0.783)，表明其基因型頻率分布已達到遺傳平衡，具有群體代表性。

M：Marker；2,3,5：AA基因型；4,6,7：AG基因型；1,8：GG基因型

2.2.2BDNF G196/A多態性與SAD的相關性分析 兩組中AA、AG及GG3種基因型頻率 (χ2=0.012 9，P=0.994)和A、G等位基因頻率的差異無統計學意義(χ2=0.012 8，P=0.910)。按性別分層分析，兩組男性基因型頻率(χ2=0.302,P=0.860)和等位基因頻率(χ2=0.117,P=0.732)差異無統計學意義；女性的基因型頻率(χ2=0.780,P=0.677)和等位基因頻率(χ2=0.511,P=0.475)差異無統計學意義。<65歲的人群中，等位基因(χ2=6.059 5,P=0.013)及基因型分布(χ2=6.082 6,P=0.047 8)有顯著差異，而≥65的人群中則無差異。

2.3血清BDNF的表達 SAD組血清BDNF水平(17.21±3.15)ng/ml明顯比對照組(21.85±5.42)ng/ml低(U=5.408 5，P<0.001)；在SAD組中，AA基因型的患者血清BDNF水平(14.32±4.21)ng/ml均比AG基因型患者(17.05±3.53)ng/ml和GG基因型患者(19.42±3.36)ng/ml低(F=7.254 5，P=0.001 6)，提示了基因的表達影響了BDNF的表達。

表1 BDNF基因的功能性多態(rs6265)等位基因及基因型在SAD和正常者中的分布比較〔n(%)〕

3 討 論

BDNF作為神經營養因子中的一個重要成員,在中樞神經系統(CNS) 廣泛地表達,但主要存在于海馬、皮質和紋狀體中，可保護神經元對抗神經毒性物質、局部缺血和氧化等各種損傷,防止內源或外源因素導致的細胞凋亡。在體內,BDNF與神經元存活、增殖、軸突生長、突觸可塑性以及學習和記憶等有密切的關系〔4，5〕。如果海馬內BDNF基因的缺失，可導致大鼠記憶和空間知覺能力的損害〔6〕。和正常海馬相比，SAD 患者海馬、顳葉皮層、內皮層及齒狀回中BDNF表達明顯降低〔7，8〕。本研究說明了SAD患者中，AD與 BDNF rs6265多態性相關，提示了BDNF表達水平及隨后的蛋白水平的改變可能參與了SAD 的早期病理過程。

遺傳多態性廣泛存在于基因組中，對于研究個體的表型差異、不同群體和個體對疾病的易感性、對各種藥物的耐受性以及對環境因素的反應性等具有重要的意義。單核苷酸多態性是人類基因組中最常見的一種遺傳多態，因此被廣泛應用于疾病易感基因的定位及連鎖和關聯分析。rs6265是位于BDNF基因的編碼外顯子，是目前已知的BDNF基因的功能性多態,其G/A多態導致第66位氨基酸密碼子的改變,使編碼氨基酸發生Val-Met(擷氨酸-蛋氨酸)的轉換,并影響BDNF的分泌〔9〕。有報道，大鼠大腦皮層及海馬和血清BDNF水平有相似的變化，且血清BDNF與皮質 BDNF 的水平呈正相關〔10〕。對AD患者BDNF表達的進一步研究顯示，AA、AG及GG3種基因型中，AA基因型的患者的血清BDNF水平最低，提示了AA基因型能降低BDNF的表達，與Ventriglia等〔11，12〕報道的攜帶 A/A基因型者患AD 的危險性比攜帶G等位基因者明顯增高的結論相似。由于BDNF通過刺激生長激素抑制素的表達，從而增加β-淀粉樣蛋白的降解〔13〕，因此，AD患者的BDNF水平下降，β-淀粉樣蛋白的降解速度減慢，從而導致β-淀粉樣蛋白的沉積。而β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積在AD的發病中起重要作用，胞外Aβ的增加和沉積是神經原纖維纏結、神經元功能喪失和神經元死亡的始動環節，也就是AD發生的起始〔14〕。

綜上，BDNF基因的功能性多態-rs6265降低了BDNF的表達，引起了SAD的早期病理過程。

4 參考文獻

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