單核細胞趨化蛋白-1基因多態性與青海藏族肺結核易感性的關系

楊青巖 楊發滿 李 軍 李曉平 汪遠浚 張培莉 高 慧

(青海大學附屬醫院老年科，青海 西寧 810001)

結核病是一種復雜疾病，研究表明，遺傳因素決定結核發病的可能性〔1〕。17q 11.2染色體區域與結核病易感性連鎖〔2〕，此區域編碼包括單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及幾種趨化因子在結核病的免疫反應中發揮重要作用。MCP-1基因啟動因子區-2518位點G/A多態性具有重要的生物學意義〔3〕。國內未見在藏族結核人群中與MCP-1基因-2518位點G/A的GG基因型相關研究，本文擬揭示發病機制，為特異性診斷、生物治療和疫苗研制提供新的靶點。

1 對象與方法

1.1對象 以西寧市的結核病防治結構為單位，收集結核病醫院、青大附院呼吸科、老年病科及玉樹州、果洛州等地區疾控中心2011年7月至2012年8月新發肺結核病例60例，年齡16～72歲，中位年齡42歲，其中男44例，女16例，均為初治患者，藏族。肺結核的診斷標準參照文獻〔4〕，排除其他傳染病及慢性病(如支氣管哮喘、肺炎、肝腎疾病、糖尿病、腫瘤、遺傳性過敏性疾病等)患者，排除器官移植、獲得性免疫缺陷病毒(HIV)感染及長期使用糖皮質激素者，選取同時期在青大附院體檢中心體檢患者60例為對照，年齡17～72歲，中位年齡42歲，男44例，女16例，均排除肺結核病史，其他排除標準同病例組，均為藏族，以年齡差≤3歲和性別與病例組進行1∶1匹配。

1.2調查內容及方法 由進行過培訓的我科醫師，應用設計的調查表調查研究對象的年齡、性別、民族、婚姻、職業、文化程度、體重指數、卡介苗接種史、結核患者密切接觸史(直接接觸親屬、同事和同學中有患結核病者)、吸煙史、飲酒和健身活動、工作環境化學煙霧和粉塵暴露情況、接受衛生宣傳教育情況。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3主要試劑與儀器 (1) 試劑包括 DNA zol BD Reagent,platinum TaqDNA聚合酶(Invitrogen);異丙醇，75%乙醇(廣州化學試劑廠);PvuⅡn內切酶(NEB)；西班牙電泳瓊脂糖(BIOWEST),引物均有Invitrogen公司合成。(2)儀器 PCR儀，電泳儀 (Bio-Red),高速離心機，移液器，制冰機(北京長流)漩渦振蕩器(江蘇其林貝爾)。

1.4實驗步驟

1.4.1DNA提取 (1)0.5 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入1 ml DNAzolBP試劑漩渦振蕩。(2)加入0.4 ml異丙醇漩渦振蕩，室溫放置5 min,6 000 r/min離心6 min,去上清；(3)加入0.5 ml DNAzolBD試劑，漩渦震蕩至沉淀全部溶解，6 000 r/min離心5 min,去上清。(4)加入1 ml 75%乙醇，吹吸數次混勻沉淀。6 000 r/min離心5 min,去上清，重復一遍。(5)空氣干燥5～10 min,加入0.1 ml ddH2O充分溶解。

1.4.2PCR引物 (1)引物: Manocyte chemoattractant protein,MCP-1;正義:5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3';長義：5'-GTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3';長度：929 bp;(2)PCR反應體系: 10×PCR緩沖液5 μl; d NTP Mixture (10 mmol/L)1 μl; MgCl2(50 mmol/L)1.5 μl;正義：10 μmol/L 1 μl;反義：10 μmol/L 1 μl;PlatinumR Tag DNA多聚酶0.2 μl;DNA 2 μl;H2O38.3 μl;總共50 μl；(3)PCR 條件 94℃ 2 min; 94℃ 30 s,63℃ 30 s 72℃ 5 min。

1.4.3PCR產物電泳 配置1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μl PCR產物電泳檢測。

1.4.4酶切 ①酶切體系：NE緩沖液4 2 μl，Puv Ⅱ0.5 μl，PCR產物 500 ng(5～10 μl)，H2O Xμl，總共20 μl 。②酶切條件：37℃ 150 min,80℃ 20 min。

1.4.5電泳 配置2%瓊脂糖凝膠，取5 μl 酶切產物電泳檢測酶切結果。

1.5實驗結果 酶切產物電泳顯示單一929 bp條帶，待檢樣本MCP-1-2518為A/A型；酶切產物電泳顯示223 bp和706 bp兩條條帶，待檢樣本MCP-1-2518為G/G型；酶切產物電泳顯示929 bp，223 bp和706 bp三條條帶則待檢樣本MCP-1-2518為A/G型。見圖1，圖2。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、單因素分析和多因素分析。

2 結 果

2.1遺傳平衡檢驗結果 AA、GA和GG基因型在病例組的分布頻率分別為分別為12/60(20%)、30/60(50%)和18/60(30%) ,在對照組的分布頻率分別為6/60(10%)、12/60(20%)和42/60(70%)(χ2=3.24，P>0.05)。

2.2單因素分析結果 環境因素中有統計學意義的因素有文化程度、卡介苗接種史、結核患者密切接觸史、體重指數、心理健康程度、蛋白質及蔬菜攝入、吸煙史、室內環境衛生、工作環境粉塵暴露、勞動強度；兩組基因型頻率的差異顯著(χ2=24.041，P<0.01)

2.3多因素分析結果 介苗接種史、吸煙史、心理健康、臥室人數、居住環境采光情況、工作環境粉塵暴露和家庭人均月收入與-2518MCP-1基因型的表達相關。見表1。

圖1 患者組MPC-1-2518實驗結果

圖2 對照組MCPT1-2518實驗結果

表1-2518MCP-1基因型與藏族肺結核發病的多因素回歸分析結果

自變量β值標準誤 χ2值P值OR值95%CI卡介苗接種史0.6660.19311.891<0.011.9471.333～2.843吸煙史0.5540.1789.688<0.011.740 1.228～2.466心理健康0.1730.1052.737>0.051.1890.969～1.460臥室人數0.3290.10410.079<0.011.3901.130～1.703居室環境采光情況0.2140.1223.079>0.051.2390.975～1.574工作環境粉塵暴露0.1820.0963.637>0.051.2000.995～1.448家庭人均月收入-0.3230.1733.497>0.050.7240.516～1.016基因型 AA--7.3670.025-- GA0.6870.2786.1240.0131.9891.154～3.428 GG0.2280.2680.7240.3951.2570.742～2.127

3 討 論

目前，篩選易感基因最常用方法為候選基因法〔5〕， MCP-1對單核巨噬細胞具有明顯的趨化作用，它是趨化因子CC的亞族成員，可趨化單核、巨噬細胞到炎癥反應部位，可由單核細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等分泌。Rovin等〔6〕發現，MCP-1基因2518位點G/A多肽性影響基因轉錄活性，從AG或GG基因型個體分離出的細胞，較AA個體產生更多的MCP-1,從而可以證實在MCP-1基因啟動子區-2518位點為G的個體，相同條件下，較AA個體能產生更多的MCP-1,引起更強大炎癥反應。

本研究結果與漢族人群及墨西哥和韓國人人群研究不同〔7〕，如果其 MCP-1 基因中的一個單核苷酸多態性(SNP)攜帶AG和GG基因型將比攜帶純和的AA基因型的人發生活動性結核的概率高出 2.3 ～ 5.4 倍；而在韓國受試者中概率高6.9 倍。在亞洲人亞組實驗中，等位基因A與結核病易感性有相關性。由于MCP-1能趨化免疫細胞至感染病灶，因此在結核菌感染早期免疫應答中MCP-1扮演著重要角色。但是，高水平MCP-1蛋白質能抑制免疫應答相關蛋白質白介素(IL)-12的產生，如IL-12表達過低，感染灶免疫細胞不能有效活化，致使機體易遭受病菌入侵。攜純和的 GG 基因型的受試者，血漿中MCP-1 蛋白質量最高，而 IL-12 p40蛋白質含量最低；更容易感染肺結核。造成本研究結果原因可能有以下幾點：(1)MCP-1在疾病中的雙重作用，就MCP-1生物學功能基因定位和調節信號傳導機制及受體的特性及與基因細胞因子和炎性細胞等協同作用研究將為肺結核的病因病學提供更多的資料,MCP-1的調節比較復雜，具有組織的特異性,有關單核細胞趨化性調節的研究進一步研究以細胞因子與種族異質性有關,因此需進一步開展對MCP-1基因多態性、MCP-1濃度及大樣本研究；(2) MCP-1 基因可能與其他基因連鎖不平衡或相互抵消其對結核病易感性的影響，人類白蛋白抗原與腫瘤壞死因子(TNF)-α相關，而TNF-α與IL-10平衡對控制和傳播肺結核起著重要的作用〔8〕；(3)結核病易感性既有遺傳因素的影響，也受環境因素的影響，以往研究結果表明，卡介苗接種史或結核病暴露史與TNF-α-238的基因型存在相互作用〔8〕；(4)基因與基因或基因與環境因素之間的相互作用尚有待進行深入研究。

4 參考文獻

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