肝細胞肝癌NTS的表達與炎癥微環境形成和腫瘤上皮間質轉化及預后的關系

李 凱 楊鎖萍 丁為民

(南方醫科大學珠江醫院腫瘤中心，廣東 廣州 510282)

肝細胞肝癌〔1, 2〕(HCC)是一種高死亡率的原發性肝癌。雖然對于早期HCC的治療采用手術切除治療有效，但術后復發率亦很高，主要原因是HCC的侵襲性較高，并且向肝內外轉移。有研究表明，肝臟炎癥和纖維化環境在HCC的發生中具有重大的影響，并且學者們對炎癥微環境〔3〕在促進腫瘤轉移和侵襲中發揮的作用也越來越關注。有研究證實，慢性炎癥和神經降壓素/白介素-8(NTS/IL-8)炎癥通路活化介導的炎癥反應能通過誘導上皮間質轉化(EMT)促使結腸癌和乳腺癌轉移侵襲〔4〕。本研究使用免疫組織化學法檢測NTS、炎癥相關因子以及EMT相關蛋白，旨在探討NTS和炎癥微環境在HCC轉移侵襲轉移中的作用及預后的參考意義。

1 資料與方法

1.1對象選擇 選擇2011年8月至2013年10月來我院通過部分肝切除術術后病理確診為HCC患者78例，回顧性分析所有患者的資料，其中男42例，女36例；平均年齡(66.25±5.26)歲。患者臨床分期，36例Ⅰ期、22例Ⅱ期和20例Ⅲ期；按HBV感染分有45例無感染的，33例感染者；按有無飲酒史分為有21例無飲酒而56例有飲酒史的。所有患者術前均未接受其他放化療。術后進行隨訪24～38個月。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法〔5〕每個樣品均經過常規脫蠟、修復抗原、去內源性過氧化物酶和牛血清蛋白封閉，然后將準備好的單克隆抗體(IL-8)、 基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、上皮細胞鈣黏蛋白(E-Cadherin)、β-連環蛋白(β-Catenin)和波形蛋白(Vimentin)滴上，4℃下過夜充分結合，37℃下二抗反應30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，用蘇木精復染?？瞻滋幚?，磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗作為對照。所有樣品在光學顯微鏡下觀察。每例標本隨機選擇10個400倍鏡視野，每個視野計數100個細胞。

1.2.2評價指標 細胞染色陽性率(PR)，染色陽性細胞所占的比例，陽性細胞為細胞質或膜出現棕黃色顆粒，范圍0～3，分別對應≤10%、11%～30%、31%～60%和>60%。同時，按著色強弱，0～3表示無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色。蛋白低表達/不表達為這兩種評定方法合計分少于4分，否則為蛋白高表達。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件，計數資料使用χ2檢驗；計量資料兩組間比較使用t檢驗；多組采用方差分析；相關分析采用Spearman秩相關。

2 結 果

2.1NTS的表達和炎癥相關蛋白的情況 78例患者肝癌組織細胞質中棕黃色顆粒NTS的表達陽性率是19.23%，15例標本中NTS平均PR是(50.06±10.19)%；IL-8的表達陽性率是55.13%，43例標本中NTS平均PR是(50.76±11.58)%；MMP-9表達陽性率是44.87%，平均PR(46.32±13.77)%，而VEGF的表達陽性率48.72%，平均PR(43.81±15.25)%。NTS陽性的標本中有86.67%(13/15)表達IL-8，而NTS陰性的標本中僅有47.62%(30/63)表達IL-8，且NTS與IL-8表達存在正相關關系(Rs=0.296,P=0.006)，HCC患者中NTS陽性組IL-8、MMP-9和VEGF的表達均顯著高于陰性組(P<0.05)。見表1。

2.2NTS的表達和EMT相關蛋白的情況 通過觀察NTS和IL-8表達均陽性的肝癌樣本，發現膜E-Cadherin丟失表達，而細胞質中β-Catenin和Vimentin增加積累。經過相關性分析發現，肝癌患者組織中的E-Cadherin和β-Catenin表達與IL-8表達水平存在關聯(R=0.302，0.259，P=0.302，0.031)，顯示在HCC中，NTS/IL-8炎癥通路的異?；罨瘜е律弑磉_的IL-8可能引起EMT。

表1 不同NTS表達組的IL-8、MMP-9和VEGF表達情況±s,%)

2.3NTS的表達與HCC患者預后的關系 78例HCC患者在不同乙型肝炎病毒(HBV)感染、飲酒史和臨床分期之間的總生存期OS差異無統計學意義(P>0.05)，然而，對NTS和IL-8進行單因素分析發現，兩組對患者的生存期存在重要影響，NTS陽性組和IL-8陽性組患者生存期均短于陰性組(P<0.001)。見表2。

表2 HCC患者不同臨床參數對生存的影響±s)

3 討 論

HCC是全球最為常見的致死性惡性腫瘤之一，導致HCC發病的主要危險因子有飲酒、肝炎病毒、黃曲霉素B1攝入等〔6〕。由于我國是乙型肝炎高發區域，因而也是HBV相關性HCC的高發地區，HCC在我國的發病率位居前列。隨著社會和科學技術的發展，人類對HCC的發病機制、診斷技術及治療方法也取得一定的進步。但是對于大部分HCC患者來說，由于缺乏有效的早期診斷和病程判斷的標志物往往確診后已失去手術機會，且術后復發轉移的概率較大，極差的預后。近年來，有研究報道，約80%的HCC患者發生在病毒性肝炎引起的慢性炎癥和肝硬化的前提下，提示肝臟炎癥微環境對HCC的發生及發展起到重要作用〔3,7〕。文獻表明，NST作為一個含有13個氨基酸的神經肽，它也是給惡性腫瘤提供生長信號的一種神經內分泌肽〔8〕。另外，有研究者支持，EMT不僅與腫瘤的轉移和侵襲密切相關，還能促使腫瘤細胞獲得干細胞的特征，進而影響到腫瘤的預后〔9,10〕。

本研究提示NTS/ IL-8炎癥通路的活化促進腫瘤微環境中釋放多種炎癥因子。文獻報道，NTS在正常成熟的肝臟和原發性肝癌組織中不表達，在胎兒肝臟短暫表達〔11,12〕。本研究的結果意味著在一些肝癌標本中存在NST異位表達，這與以往的研究結果一致。同時，提示NTS/ IL-8炎癥通路的異常活化導致升高表達的IL-8可能引起EMT。EMT是一個上皮細胞經過多次生化變化的生物過程，可具有一個間質表型，這個表型是上皮源性癌癥復發和轉移的重要分子基礎〔13〕。本研究還發現NTS和IL-8對患者的生存期存在重要影響，提示NTS/ IL-8炎癥通路的異常激活影響患者術后預后效果，這可能是通路活化引起慢性炎癥和EMT的原因，最后引起HCC轉移和侵襲增加。

綜上所述，在HCC患者中存在NTS/ IL-8炎癥通路的異常激活，NTS的表達與炎癥微環境形成能促進腫瘤上皮間質轉化及對患者預后產生不良影響。

4 參考文獻

1金 棟,馬 麗,徐 俊,等.趨化因子受體CXCR7在人肝癌細胞株中的表達及意義〔J〕.寧夏醫科大學學報,2012;34(6):588-91.

2王曉林,熊枝繁,曹仕瓊,等.肝細胞肝癌組織MCM2和FAP-1表達及其與癌細胞增殖和凋亡的相關性研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2011;18(3):205-7.

3曹亞娟.炎性指標與肝細胞肝癌相關性研究進展〔J〕.實用中醫藥雜志,2012;28(3):232-4.

4Na DC,Lee JE,Yoo JE,etal.Invasion and EMT-associated genes are up-regulated in B viral hepatocellular carcinoma with high expression of CD133-human and cell culture study〔J〕.Exp Mol Pathol,2011;90(1):66-73.

5蔣家好,樊 嘉,周 儉,等.肝細胞肝癌中核RNA輸出因子3的表達及其意義〔J〕.中國臨床醫學,2013;20(5):613-5.

6曹亞娟.炎性指標與肝細胞肝癌相關性研究進展〔J〕.實用中醫藥雜志,2012;28(3):232-4.

7Hao H,Liu M,Wu P,etal.Lipoxin A4 and its analog suppress hepatocellular carcinoma via remodeling tumor microenvironment〔J〕.Cancer Lett,2011;309(1):85-94.

8Massa F,Tormo A,Beraud-Dufour S,etal.Neurotensin-induced Erk1/2 phosphorylation and growth of human colonic cancer cells are independent from growth factors receptors activation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2011;414(1):118-22.

9Eades G,Yao Y,Yang M,etal.miR-200a regulates SIRT1 expression and epithelial to mesenchymal transition (EMT)-like transformation in mammary epithelial cells〔J〕.J Biol Chem,2011;286(29):25992-6002.

10葉英楠,王 越,王 揚,等.肝細胞肝癌上皮間質轉化的相關分子機制〔J〕.國際腫瘤學雜志,2013;40(8):608-11.

11張同先,牛 昀,張 巍.神經降壓素及其受體1與乳腺癌〔J〕.國際病理科學與臨床雜志,2012;32(2):145-9.

12劉芃芃,陳永孜,任秀寶,等.肝細胞肝癌NTS的表達與炎癥微環境形成和腫瘤上皮間質轉化及預后的相關性研究〔J〕.中國腫瘤臨床,2013;40(19):1150-4.

13孫 斌,殷正豐.肝癌細胞的上皮間質轉化〔J〕.中華腫瘤雜志,2012;34(10):721-4.