131I標記槲皮素的方法

魏 凱 李 悅 張苗苗 王 博 崔亞利

(哈爾濱醫科大學附屬第三臨床醫學院，黑龍江 哈爾濱 150081)

131I是治療分化型甲狀腺癌最特異、最有效的放射性藥物，可以被甲狀腺組織高選擇性地吸收，療效確切。然而，在分化型甲狀腺癌的病變進展過程中，細胞可以出現失分化現象。研究指出，在分化型甲狀腺癌轉移的患者中，約有1/3可能發生失分化〔1〕。失分化使患者攝碘能力減低或喪失，使131I治療無效，成為困擾醫生及患者亟待解決的問題。槲皮素可以誘導腫瘤細胞凋亡，使失分化及未分化甲狀腺癌再分化，且對放療具有增敏作用。本文擬用131I標記槲皮素，以期尋找一種新的靶向藥物可以提高甲狀腺癌內放療的療效，減少失分化的發生，且達到對失分化及未分化的甲狀腺癌行再分化治療的目的。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與細胞 槲皮素二水合物(美國Sigma 公司產品)，Na131I溶液(成都中核高通同位素股份有限公司)；氯胺T(Ch-T)，焦亞硫酸鈉，甲醇，去離子水，玻板，氧化鋁，微-晶纖維素，磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自北京化學試劑公司；甲狀腺癌細胞FTC-133/8505C,美國實驗室惠贈。

1.1.2儀器 CRC-15BETA 放射性活度計(美國 Capintec 公司)，SN-695B 型放免 γ 測量儀(上海核所日環光電儀器有限公司)，酶標儀(美國 Thermo 公司)，離心機(德國 Hettich Zentrifugen公司)，電子細胞數計數器(美國Beckman Coulter公司)，電子分析天平(德國Sartorius公司)， 薄層放射性掃描儀(瑞士CAMAG公司)。

1.2方法

1.2.1131I標記槲皮素的制備 應用氯胺T法對槲皮素行131I標記，取50 μg槲皮素溶于10 μl酸性甲醇中，待槲皮素完全溶解后與20 mBq Na131I溶液混合，然后加入Ch-T，充分混勻，室溫靜置30 min后用偏重亞硫酸鈉溶液終止反應，標記完成。在對131I標記槲皮素的方法學探討中，改變標記條件，選定5個影響標記結果的重要因素并分別選取不同的水平：氯胺T用量5～45 μg；槲皮素用量40～140 μg：反應體系的pH 2.0～11.0；反應溫度4℃～37℃；反應時間1～30 min，分別測定標記率。經3次水洗，131I-Qu從游離131I中被純化。離心分離后，游離131I從水溶液中去除。平行試驗中，在同等條件下，樣品中沒有Ch-T被用于131I與槲皮素的任何反應中，作為空白對照組。

1.2.2質量控制 應用兩種不同的薄層色譜法(TCL)作質量控制：一種是TCL氧化鋁片(F254中性)，用甲醇作為流動相，另一種是TLC纖維素薄片，用甲醇-乙醚(20～80 V/V %)作為流動相。

1.2.3體外穩定性測定 將標記物投入到1 ml人新鮮血清中，置于37℃水浴箱中溫育，分別測定標記物標記后24 h內1、2、4、8、24 h不同時間點的放化純度。

1.2.4131I-Qu的結合率測定 采用細胞免疫結合率測定法測定131I-Qu的免疫活性。取對數生長期的甲狀腺癌細胞(FTC-133/8505C)，制成 1×106、5×106、1×107、5×107、1×108/ml的細胞懸液，取0.05 ml置于微量離心管，4個復管。加入20 μl經PBS稀釋的131I-Qu，混勻后4℃放置4 h，γ測量儀測總放射性活性T，然后低溫離心5 min(2 000 r/min)，磷PBS洗3次，測定沉淀細胞的放射性活性B，計算結合率(免疫結合率=B/T×100)。對照組中加入游離的131I，其余步驟同上。

2 結 果

2.1131I標記槲皮素的標記條件 對照組未加入Ch-T純化，沉淀物中未檢測到放射性活性。

2.1.1Ch-T用量對標記率的影響 在固定槲皮素用量100 μg，pH6.0，室溫和反應時間為5 min的情況下，131I-Qu的標記率隨Ch-T用量增加而增加；當Ch-T為25 μg時，標記率可達(98.3±0.4)%，放化純可達(98.8±0.3)%。但當Ch-T用量增加至30 μg時，標記率下降，為(85.4+0.5)%，兩者差異有統計學意義(F=42.7，P<0.01)。見圖1。

2.1.2槲皮素用量對標記率的影響 在Ch-T用量25 μg，pH6.0，室溫條件下反應5 min，當槲皮素量為40～80 μg時，隨著槲皮素用量的增加，標記率亦在增加；當槲皮素用量達到約82 μg時，標記率幾乎已經達到最高。但為了能得到較高的標記率，因此，本實驗中槲皮素用量為100 μg。見圖2。

2.1.3pH值對標記率的影響 在固定Ch-T用量25 μg，槲皮素用量100 μg，室溫條件下反應5 min，當pH6.0時，得到了最高的標記率，當pH<6.0時標記率隨著pH值的減小明顯下降，當pH>6.0時標記率隨著pH值的升高亦明顯下降。見圖3。

圖1 Ch-T用量對標記率的影響

圖2 槲皮素用量對標記率的影響

圖3 pH值對標記率的影響

2.1.4反應時間及反應溫度對標記率的影響 將反應時間設為1、5、10 min，標記率分別為(98.1±0.6)%、(98.2±0.2)%、(98.16±0.3)%，組間差異無統計學意義(F=0.25，P>0.05)。將反應溫度設定為4℃、室溫37℃時，其標記率分別為(97.5±1.2)%、(98.3±1.0)%、(97.6±1.4)%，組間差異無統計學意義(F=0.06，P>0.05)。

2.2質量控制 應用兩個薄層色譜系統，薄層色譜中應用氧化鋁(Al2O3)和纖維素作為固定相，為131I-Qu和游離131I執行質量控制,效果良好。圖4為一個典型的結果，應用兩個薄層系統在125I -Q (A和C)和空白反應(B和D)。

A：應用TCL，Al2O3，第一峰為131I-Qu，第二峰為游離131I；B：應用TCL，Al2O3，出現鋒為游離131I；C：應用TCL，纖維素，第一峰為游離131I，第二峰為131I-Qu；D：應用TCL，纖維素，第一峰為游離131I

2.3131I標記槲皮素的體外穩定性131I-Qu在 37℃條件下放置，見圖標記物于1、2、4、8、24 h放化純度分別為96.2%，95.9%、94.6%、93.3%、90.6%，測得放射化學純度隨時間逐漸呈緩慢下降趨勢，至 24 h時所測值仍大于90%，說明131I-Qu體外穩定性良好。

2.4131I-Qu的結合率測定131I-Qu 的細胞結合率中 5×104、2.5×105、5×105個細胞組與 2.5×106、5×106個細胞組間差異有統計學意義(P<0.01)，5×104、2.5×105、5×105個細胞組間差異無統計學意義(P>0.05)，2.5×106、5×106個細胞組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 131I-Qu與FTC-133/8505C細胞的結合率±s,n=3,%)

3 討 論

用放射性核素標記配體(如腫瘤血管靶向性肽、抗體或小分子化合物等)作為示蹤劑，使之與高表達的受體分子結合，從而使腫瘤顯像并對腫瘤細胞進行殺傷〔2〕。此外，與單獨化療藥相比，將其與腫瘤導向治療藥物聯合，可以達到增強腫瘤治療療效、降低藥物毒性和不良反應的目的〔3〕。

放射性核素131I早于1984年就開始運用于導向治療研究，既可應用于甲狀腺疾病的診斷及特異性靶向治療，還可應用于抗體、配體和反義核苷酸等的標記。本實驗利用放射性核素131I標記，其優勢在于：具有適宜的半衰期(8.02 d)；適宜的衰變能量；131I 釋放的β射線能量為 607 kev，其殺傷半徑大于50個細胞，可用于放射性核素內照射治療；131I 還釋放能量為 364 kev的γ射線，可作為示蹤劑用于放射性核素顯像。

本實驗采用氯胺-T 法利用131I標記槲皮素。標記物分子結構較穩定，反應溫和。標記產物131I -Qu的標記率較高，在37℃條件下其放射化學純度仍然大于90% ，表明131I -QU 結合較穩固，脫碘不明顯，具有良好的穩定性，有利于后期的實驗研究。

放射性131I標記多肽的標記率受到很多因素的影響，但多肽分子中酪氨酸殘基數目的多少、多肽分子中酪氨酸殘基暴露的程度是最主要的因素。此外，影響標記反應的因素還包括(1)放射性碘的選用〔4〕：應選用新鮮的、比放射活度高的、無載體的、含還原劑量少的。(2)放射性碘與抗體用量的比例〔5〕：二者的比例會嚴重影響標記結果，一般情況下不應該投入過多的碘源，通常當投入的碘量一定時，抗體用量越多，碘的利用率越高，但得到的標記化合物比放射活度低；相反情況，抗體用量越少，那么碘的利用率則降低，但所得標記化合物比放射性則高，比放射活度會隨此比值變化有較大的變動。(3)Ch-T的用量及碘化反應時間〔4〕：早期用氯胺 T 法作碘化標記時，一般Ch-T用量都比較大，致使嚴重毀傷了抗體結構和生物學活性。大量應用氯胺 T 是無益于實驗的，其結果可能反而導致標記化合物活性下降。當然，也不能盲目減少Ch-T的用量，否則碘源中還原劑量過多，將會導致標記實驗失敗。許多標記試驗中可以采取延長反應時間的方法提高標記率，但是氯胺T碘化法中一定要嚴格控制反應時間，反應時間過長會導致標記的多肽或抗體嚴重失活，理論上來講，碘化反應時間通常在1 min，但是根據我們的實驗，5 min時反應體系的標記率較高，低于5 min時，所得的標記率及放化純都不甚理想。(4)根據不同化合物的性質決定多肽的pH值、酸、堿的反應條件〔6〕，反應溫度和反應時間也是標記率的重要影響因素，時間太短,不完整,標記率很低；時間太長,容易破壞標記物的生物活性。

薄層色譜法是一種微量、簡便、快速的分離方法，適用于微量樣品的分離、鑒定和制備。

槲皮素是一種天然黃酮，廣泛存在于植物的花、葉、果實中，生物學活性及藥理作用廣泛，具有抗氧化、有抗炎、降糖降壓、免疫調節等作用，并且可抑制多種腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡〔7〕。本課題組已經證實〔8〕，在體內外實驗中槲皮素均可以提高放療的敏感性,其機制可能與靶向作用于ATM介導的放療反應通路有關。

本研究顯示，采用氯胺T法131I標記槲皮素的方法是可行的，在最佳標記條件下，其標記率和放化純均>95%，方法簡單，克服了間接標記需對槲皮素進行化學修飾及對其功能基團進行保護和去保護處理等不足，標記產物體外穩定性好，與細胞結合率較好。因此，131I -Qu是一種具有潛在應用價值的靶向新型抗腫瘤治療藥物。

4 參考文獻

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3Harwood M, Nielewska-Nikiel B, Borzelleca JF,etal. A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity, including lack of genotoxic/carcinogenic properties〔J〕.Food Chem Toxicol,2007;45:2179-205.

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8Hosseinimehr SJ, Tolmachev V, Stenerl?w B.125I-labeled quercetin as a novel DNA-targeted radiotracer〔J〕. Cancer Bioth Radiopharm,2011;26(4):469-75.