大鼠顱腦損傷后MMP-2和MMP-9表達的變化及與損傷時間的關系

馬 晨 劉曉智 劉振林

(天津市第五中心醫院神經內科，天津 塘沽 300450)

創傷性顱腦損傷(TBI)是最常見的機械性損傷之一，原因包括道路交通事故損傷、高空墜落損傷和攻擊損傷，極容易導致死亡，顱腦損傷占創傷總數15%，但死亡率卻占創傷總數的85%〔1〕?；|金屬蛋白酶(MMP)-2和-9又稱基質溶素-1，主要由巨噬細胞、結締組織細胞和腫瘤細胞生成。TBI導致血腦屏障損傷，MMP-2 和 MMP-9對TBI死亡細胞的清除扮演著重要的作用，是調節TBI損傷的重要細胞因子之一。本研究探討大鼠顱腦損傷后MMP-2 和 MMP-9表達的變化及與損傷時間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用健康成年SD大鼠96只，由本院中心實驗室提供，體重(250±50)g，雌雄不分，置于安靜、溫暖、避強光的環境中分籠飼養。

1.2試劑和裝置 試劑：MMP-2和MMP-9兔抗鼠單克隆抗體(購于凱基生物公司)，二抗、DEPC及SABC試劑盒、DAB顯色劑等(購于上海生工生物公司)。裝置：定向儀、PVC管、鐵制砝碼和鐵質撞擊小錘組成(由中心實驗室提供)。FTC-2000 型實時熒光定量PCR儀(由中心實驗室提供)。

1.3大鼠腦外傷模型建立

1.3.1實驗動物分組 運用隨機數列表，把大鼠隨機分為A組(正常對照組)8只、B組(假損傷組)8只和C組(損傷組)80只。C組又分為10組,分別為C1組損傷后 (1 h)，C2組損傷后(6 h)，C3組損傷后(12 h)，C4組損傷后(24 h)，C5組損傷后(2 d)，C6組損傷后(3 d)，C7組損傷后(5 d)，C8組損傷后(7 d)，C9組損傷后(10 d)，C10組(14 d)共，每組8只。

1.3.2實驗模型制作 將大鼠稱重后吸入乙醚麻醉后，剪去頂部鼠毛，按照0.35 g/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，消毒皮膚后，將大鼠固定于定向儀裝置內，將撞擊小錘放入骨窗內，沿中線切開頭皮長約1.5～2.5 cm，分離骨膜，用牙科鉆磨開顱骨，以前囟后1.5 mm、中心右側2.5 mm為中心，形成直徑5 mm骨窗，保持硬腦膜完整。將鐵質砝碼放入 PVC管并安裝在立體定向儀上，經調節使鐵質砝碼底面恰與撞擊小錘底面完全接觸。懸吊40 g鐵制砝碼，使之自25 cm高處自導管內自由下落撞擊小錘。撞擊后即刻移開砝碼，取出撞擊小錘，壓迫止血后用鋅汀粉封閉骨窗，縫合頭皮，置回鼠籠喂養。假損傷組只開窗不撞擊，正常對照組不作任何處理。

1.4免疫組化染色 大鼠顱腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，用PBS沖洗3次后，用羊血清孵育，MMP-9兔抗鼠單克隆抗體作為一抗，SABC法免疫組織化學染色，DAB顯色均按說明書進行，蘇木素復染，PBS作為陰性對照；另做常規HE染色。

對MMP-9免疫組化染色陽性反應物進行檢測，各組陽性面積比及陽性反應物的平均光密度值。

1.5實時定量PCR測定MMP-2和MMP-9 mRNA表達量 取大鼠顱腦組織，冰生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中保存備用，用Trizol法提取總RNA(購于上海生工生物公司)，取大鼠腦組織50～100 mg，采用熒光實時定量RT-PCR技術對逆轉錄-擴增產物進行定量分析。MMP-2：正義：5’- GCTGATACTGACACTGGTACTG-3’，反義：5’-CAA TCTTTTCTGGGAGCTC-3’，運用探針：5’-GGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGAC GGACTCC-3’，長度217 bp。 MMP-9：正義：5’- CACCGCCAACTATGACCAGGA-3’，反義：5’-AAGACGAAGGGGAAGACGCAC-3’，運用探針：5’-FAM-ACTGTAACTGGGGGCAACTCGGCAGTA MRA-3’，長度280 bp，引物都是由上海生工生物公司合成。

1.6明膠酶譜分析MMP-2和MMP-9表達量 實驗前配制明膠緩沖液:100 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris和1 μmol/L ZnCl2；洗脫液:2.5% Triton X-100。取大鼠腦組織50～100 mg，勻漿、離心，組織蛋白抽提液,SDS-PAGE電泳用0.1%明膠的7.5%聚丙烯酰胺凝膠，用Marker作為對照。結束后用洗脫液漂洗，明膠緩沖液37℃孵育18 h,在緩沖液中加入EDTA 20 mmol/L、特異性抑制劑苯甲基磺酰胺20 mmol/L,以明確所得條帶的性質。孵育結束后用考馬斯亮藍溶液染色1 h,脫色約45 min觀察條帶。

1.7統計學方法 采用統計軟件SPSS17.0進行χ2及t檢驗。

2 結 果

2.1實驗動物的一般表現 C組大鼠出現呼吸深快或暫?，F象，出現全身輕度抽搐，同時出現去皮層綜合征，如頸項強直、雙側前肢屈曲和下肢強直等。多數大鼠恢復后能自主呼吸，大約1 h可自主爬行；少數大鼠出現偏向偏癱側轉圈運動，但在6 h內能恢復。A組和B組大鼠不出現上述癥狀，B組蘇醒后恢復正?；顒?。

2.2MMP-2和MMP-9免疫組織化學染色結果 C組中,MMP-2和MMP-9陽性細胞在大腦皮層陽性細胞呈深棕黃色，位于神經元及膠質細胞的胞質內，表達量逐步增加，C1組出現陽性染色，但顏色較弱，主要為神經元；C2組染色程度與C3組差異無統計學意義，C4-C5組MMP-2和MMP-9神經元表達逐步增多，少量膠質細胞出現 MMP-9陽性染色；MMP-2在C7組染色強度達到高峰；MMP-9在C6組染色強度達到高峰；C7-C8組 MMP-2和MMP-9 陽性染色逐步減弱，C9～C10組MMP-2和MMP-9表達量逐步穩定。A組和B組中，MMP-2和MMP-9陽性細胞表達量極少,見圖1、圖2。

圖1 MMP-2蛋白的表達變化(×400)

圖2 MMP-9蛋白的表達變化(×400)

2.3MMP-2和MMP-9免疫組化分析 大鼠顱腦損傷后MMP-2和MMP-9平均光密度值與陽性面積比現出一個規律性變化，及升高-高峰期-逐漸下降期，A組與B組之間差異無統計學意義。MMP-2和MMP-9平均光密度值， C3組、 C4組、 C5組、 C6組、 C7組、 C8組、 C9組和 C10組與A組之間存在統計學意義(P<0.05)，損傷12 h后開始顯著增強(與相鄰上組比較P<0.05)，MMP-2在5 d左右達到高峰，到14 d維持在較高水平;MMP-9在3 d左右達到高峰， 到14 d維持在較高水平。對于MMP-2和MMP-9陽性面積比，顱腦損傷后C4組、C5組、C6組、C7組和C8組與A組之間存在統計學意義(P<0.05)，損傷1 d后開始顯著增強(與相鄰上組比較P<0.05)，MMP-2在5 d左右達到高峰,到7 d都維持在較高水平表達狀態，在傷后10 d表達明顯降低；MMP-9在3 d組時達到高峰，到5 d都維持在較高水平表達狀態，在傷后7 d表達明顯降低，具體見圖3、圖4。

與正常對照組比較:1)P<0.05；與上一組比較:2)P<0.05；下圖同

圖4 腦損傷后MMP-2、MMP-9陽性面積比的時相分布

2.4MMP-2和MMP-9 mRNA在各組的表達量 MMP-2和MMP-9 mRNA表達量呈現規律性變化：升高-高峰-下降期。MMP-2在C7組(5 d)出現最高峰，10 d都維持在較高水平表達狀態，在傷后10 d表達明顯降低；MMP-9在C6組(3 d)出現最高峰，7 d都維持在較高水平表達狀態，在傷后7 d表達明顯降低，見圖5。

圖5 MMP-2、MMP-9 mRNA在各組的表達量

2.5明膠酶譜分析MMP-2和MMP-9表達量 MMP-2和MMP-9分子量分別為：64、83 kD；發現表達量現規律性變化：升高-高峰-下降期。MMP-2在C7組(5 d)出現最高峰，10 d都維持在較高水平表達狀態，在傷后10 d表達明顯降低；MMP-9在C6組(3 d)出現最高峰，7 d都維持在較高水平表達狀態，在傷后7 d表達明顯降低，見圖6。

圖6 明膠酶譜分析MMP-2和MMP-9表達量

3 討 論

TBI的神經細胞損傷機制可能包括血腦屏障結構與功能受損、損傷后相關蛋白生成不足及細胞凋亡〔2〕。細胞凋亡是指在某些刺激誘導下，機體細胞膜信號被激活，啟動調控細胞凋亡的基因，導致細胞破壞或死亡。凋亡可能是通過啟動減少細胞壞死，使細胞死亡變成主動清除〔3〕。TBI后血腦屏障破壞的機制：由于外力的直接作用造成毛細血管破裂，導致血管內皮細胞缺血壞死，血腦屏障完全受損，發生不可逆損害，起初僅為部分性損傷，但以后數小時至數天內會有許多繼發性損害〔4〕。

本次研究發現，損傷后6 h出現了血腦屏障結構的破壞和腦水腫，出現毛細血管擴張,組織水腫、淤血和出血，腦組織出現炎癥。損傷1 d后神經細胞水腫，血管擴大，胞質空泡形成；3 d后損傷區腦組織出現壞死，神經膠質細胞和組織間隙出現明顯水腫現象，出現重度缺血性改變，發生繼發性腦損傷。

MMPs是一種鋅依賴性降解蛋白酶，可以降解細胞外基質分子，主要參與血管再生、炎癥反應等過程〔5〕。MMP-2和MMP-9是基質金屬蛋白酶，又稱基質溶素、前明膠酶，在細胞內以前體形式存在〔6〕。MMP-2和MMP-9作用廣泛，常由結締組織細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞產生，能降解纖維連接蛋白及Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型膠原等生成，在顱腦損傷后一系列病理生理過程中具有重要的調節作用，在血腦屏障開放、細胞凋亡、炎癥反應、損傷修復和細胞外基質重建等過程中發揮作用〔7〕。

本實驗證明在神經元組織中，血腦屏障完整時MMP-2和MMP-9表達極少量，在顱腦硬膜外損傷后，血腦屏障中MMP-2和MMP-9起到重要的積極保護作用。隨著血腦屏障結構和功能修復，7 d后腦水腫和繼發性腦缺血缺氧逐漸減輕，改變了這種惡性循環，MMP-2和MMP-9的表達逐漸恢復正常。

4 參考文獻

1Peskind ER, Brody D, Cernak I,etal. Military- and sports-related mild traumatic brain injury: an overview〔J〕. J Clin Psychiatry,2013;74(8):e17.

2Walker Buck P, Spencer Sagrati J, Shapiro Kirzner R. Mild traumatic brain injury: a place for social work〔J〕. Soc Work Health Care, 2013;52(8):741-51.

3李志恒,胡雪峰,金茂強.大鼠顱腦損傷后Caspase-9的表達變化及其法醫學意義〔J〕. 新疆醫科大學學報,2012;35(3):334-8.

4Mak CH, Wong SK, Wong GK,etal. Traumatic brain injury in the elderly: is it as bad as we think〔J〕? Curr Transl Geriatr Exp Gerontol Rep,2012;1:171-8.

5李剛蓮，劉群英，夏 鵬,等. 大鼠皮膚MMP-2，MMP-9表達與損傷時間相關性的實驗研究〔J〕. 重慶醫科大學學報，2009;34(6)：698-701.

6Vázquez-Solís MG, Villa-Manzano AI, Sánchez-Mosco DI,etal. Prognosis in pediatric traumatic brain injury. A dynamic cohort study〔J〕. Rev Med Inst Mex Seguro Soc, 2013;51(4):372-7.

7Fuller GW, Woodford M, Lawrence T,etal. The accuracy of alternative triage rules for identification of significant traumatic brain injury: a diagnostic cohort study〔J〕. Emerg Med J,2013;30(10):876.