三維鈦網支架材料對犬牙周膜成纖維細胞生物學行為的影響

張圣福 黃元丁 王 濤

(重慶市口腔疾病與生物醫學研究中心 重慶醫科大學附屬口腔醫院，重慶 401147)

牙周膜成纖維細胞(PDLFs)經證實具有異質性，除了具有成纖維性能，而且可以向成牙骨質和成骨方向分化，已經成為牙周組織工程首選的種子細胞〔1〕。三維鈦網支架(TW)是由直徑50 μm鈦絲編織而成的圓盤狀支架，高度2～10 mm，平均孔徑200 μm，孔隙率87%，Dong等學者證實此支架具有良好的生物相容性和生物安全性，較傳統的二維培養環境能有效促進細胞和組織的附著，增殖，能促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化〔2〕。TW在骨組織工程和牙周組織再生工程中具有良好的應用前景〔3〕，本實驗通過體外培養PDLFs，通過與TW支架材料三維培養，檢測TW對其附著、增殖及分化的影響，為牙周組織工程種子細胞及支架材料提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 1周歲beagle犬，由重慶醫科大學實驗動物中心提供〔動物質量合格證號：SCXK(渝)2007-0001〕。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清(Gbico)，DMEM：F12培養基(HyClone)，胰蛋白酶、I型膠原酶(Sigma)，青霉素、鏈霉素(HyClone)，地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉(Sigma)，抗波形蛋白抗體(Abcam)，抗角蛋白抗體(LSBio)，噻唑藍(MTT)試劑盒(碧云天)，AKP檢測試劑盒(南京建成)，CO2恒溫培養箱(Thermo)、超凈工作臺(蘇州醫療設備廠)、光學顯微鏡(Olympus)、倒置相差顯微鏡(Nikon)，透射電鏡、掃描電鏡(Hitachi)。

1.3方法 酶消化組織塊法體外原代培養犬PDLFs〔4〕，3%戊巴比妥鈉按腹腔注射麻醉1周歲年齡beagle犬(1 ml/kg)，2%利多卡因局部浸潤麻醉拔除上下前牙約10顆，冠向下，根朝上，用預冷無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，含200 U/ml青霉素、200 U/ml鏈霉素)反復沖洗血污3次以上，轉入生物安全柜內，用含有雙抗的無菌PBS再次反復沖洗離體牙，用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織，勿用眼科剪分，避免再次損失組織塊。將組織塊移入5 ml離心管中，加入0.1%膠原酶和0.25%胰蛋白酶各0.5 ml，37℃消化30 min，每5 min振蕩1次，當肉眼觀察到培養液略混濁，顯微鏡下見組織塊松散時，離心(800～1 000 r/min，5 min)，棄上清液，用含20%胎牛血清及雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)的DEME和F12(1∶1)培養基漂洗1次后棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪于50 ml塑料培養瓶底，翻轉培養瓶，底部朝上，向內加入上述完全培養基1 ml，置5%CO2、37 ℃培養箱孵育4 h，使組織塊貼壁，再復原培養瓶培養，3 d后更換培養基，操作時動作輕柔，避免組織塊脫離瓶底。取第3代細胞用于實驗。

1.4透射電鏡觀察超微結構 取第3代細胞，PBS漂洗，細胞刮刮取細胞，離心，稀釋制成107/ml高濃度細胞懸液，將細胞懸液加入做好的瓊脂管中(eppendorf管中加入2%的瓊脂，中間用牙簽弄個小洞)，離心后，切開eppendorf管，切去多余的瓊脂，留下包埋細胞的瓊脂塊，用2.5%的戊二醛、1%的鋨酸雙固定，梯度酒精脫水、滲透、包埋、聚合、超薄切片，染色，觀察。

1.5細胞組織來源鑒定 取第3代細胞，0.25%胰酶消化，離心，制作單層細胞爬片，用酶聯免疫(SP)法，二氨基聯苯胺(DAB)顯色進行波形蛋白和角蛋白抗體免疫細胞化學染色，設置空白、陰性對照。

1.6礦化結節實驗鑒定 取第3代細胞消化后接種六孔板，待細胞貼壁后，加入含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 μg/ml維生素C、10 nmol/L地塞米松的完全培養基，約3 w出現白色的礦化結節，PBS漂洗，95%乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗數次，0.1%茜素紅(Tris-HCl pH8.3)染色30 min，PBS沖洗數次，自然干燥，照相。

1.7TW對犬PDLFs的生物學行為的影響 取6只TW放在10 ml離心管底部，用常用細胞培養培養液4 ml，反復吹打，靜置2 h，取出預濕過的鈦網放入96孔板，取第3代細胞消化離心稀釋制成濃度104/ml細胞懸液，慢慢滴入TW內部，24 h后取出TW放入新96孔板，常規培養。取培養1 w后TW行戊二醛固定、脫水、置換、臨界點干燥、噴金、掃描電鏡觀察細胞附著增殖。取12只預濕過的TW放入96孔板為實驗組，取另12孔位對照組，再取12孔為空白組(只加入培養液)，取第3代細胞制104/ml成細胞懸液，實驗組、對照組每孔反復滴入TW 200 μl，分別培養2、4、6、8 d后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h后，小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，取出鈦網，在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值，根據各時間點，各組數據均值繪制柱狀圖。實驗組取12只預濕過的TW放入24孔板的，取第3代細胞制成細胞懸液反復滴入TW各1 ml，常規復合培養基培養，對照組取第3代細胞制成細胞懸液滴入12孔，各1 ml，采用含礦化誘導液的復合培養基培養，兩組細胞經培養24、48、72 h后消化，離心，細胞裂解液裂解，離心取上清液，用堿性磷酸酶(AKP)試劑盒檢測AKP含量。

1.8統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，實驗組和對照組在各個時間點采用方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1細胞原代培養及鑒定 組織塊經酶消化接種5～7 d，在倒置顯微鏡下可見梭形細胞從組織塊邊緣呈發射狀游出，約2 w可將原代細胞消化傳代(圖1A)。經傳代的細胞以長梭形和星形為主，也有多角形，胞體豐滿，有2～4個梭形細胞突起，胞質均勻，核圓形或卵圓形，核仁清晰，呈較典型的成纖維細胞樣形態；細胞鋪滿培養瓶時呈放射狀、漩渦狀排列(圖1B)。透射電鏡下PDLFs有豐富的粗面內質網、高爾基復合體、核糖體；顯示細胞為處于生長旺盛的PDLFs(圖1C)。光鏡下觀察免疫細胞化學染色波形絲蛋白抗體呈陽性(圖1D)，角蛋白陰性(圖1E)，證明細胞來源于中胚層，無上皮細胞來源混雜。細胞經礦化誘導培養3 w后出現礦化結節，茜素紅染色陽性，證明經培養的PDLFs具有向硬組織分化的能力(圖1F)。PDLFs在材料表面附著伸展良好，主要呈長梭形，細胞生長密集處伸出突起相互連接。

A

B

C

D

E

F

2.2PDLFs增殖比較 牙周膜成纖維附著TW后細胞增殖的幅度較單獨二維培養有所增加。見圖2。

圖2 MTT實驗檢測兩組細胞培養2、4、6、8 d后的增殖水平

2.3PDLFs上清液AKP水平比較 在24 h，兩組細胞上清液AKP分泌水平差異無統計學差異(P>0.05)，而在48、72 h，TW組分泌量顯著多于礦化誘導組(P<0.05)。見表1。

表1 上清液AKP含量(金氏單位/100 ml)比較±s)

3 討 論

PDLFs是牙周組織再生的前體細胞，是PDL 的主要細胞成分，也是PDL 的主要功能細胞，PDLFs具有成纖維表型和成骨表型，其中，成骨表型包括成牙骨質細胞表型和成骨細胞表型〔5〕，能分化為成骨細胞、成牙骨質細胞、成纖維細胞，具有形成牙骨質、牙槽骨及牙周膜的能力〔6〕。Hasegawa等〔7〕將PDLFs制成細胞皮片，再復合細胞外基質植入免疫缺陷小鼠皮下，發現有非細胞性牙骨質形成，且有大量的密集排列的膠原纖維插入其中。此外，有學者利用具有多向分化能力的PDLFs均取得了向類牙骨質和牙周膜纖維方向誘導分化的成功，使其成為牙周組織工程最重要的種子細胞〔8〕。

目前牙周膜細胞原代培養的方法主要有酶消化法和組織塊法，酶消化法操作方法復雜，獲得的細胞不純，組織塊法有細胞游出比較緩慢且數量少的缺點〔9〕。本實驗通過電子顯微鏡觀察到細胞形態均為長梭形星形或多角形細胞未發現上皮樣細胞，免疫細胞化學染色波形蛋白呈陽性反應，說明細胞來源于中胚層，角蛋白陰性排除上皮性來源細胞混雜，細胞來源可靠，透射電鏡觀察細胞超微結構，含有豐富的高爾基體和粗面內質網，說明所培養的細胞合成蛋白質功能活躍，礦化結節實驗證明其有向硬組織分化的能力。

因為鈦材料具有杰出的生物相容性和生物安全性、優良的耐腐蝕性、適宜的力學性能和良好的加工性，廣泛應用于口腔各種修復體的制作，尤其是骨結合理論的創立和發展，鈦種植體已經成為牙種植體最重要、最廣泛的一種。眾多學者將鈦材料和PDLFs等種子細胞用于牙周組織工程研究。如Choi將狗PDLFs分離培養后附著到鈦種植體表面，再植入同源性狗的下頜骨內，3個月后組織切片發現種植體表面有類牙骨質形成，并有膠原纖維垂直插入其中〔10〕。

目前，臨床上大部分種植體通過酸蝕、噴砂等手段改變種植體表面形態，但仍然屬于二維結構。TW材料可通過高溫真空焊接到鈦柱表面，形成三維結構的種植體。將高密度細胞接種在具有一定空間結構，有一定孔隙率，孔徑大小，孔間交通的支架材料上，細胞在模擬體內細胞的化學、物理和生物學條件下，在三維基質支架中進行培養稱為三維培養〔11〕。通過將體外培養的PDLFs接種到TW上復合立體培養，使與牙周組織的主要功能細胞PDLCs直接接觸，檢測材料對細胞增殖分化的影響，為TW材料構建牙周組織工程支架的可能性提供初步的研究數據，本次實驗驗證鈦網材料三維培養較二維培養具有明顯的促增殖作用。

PDLFs成骨表型和成牙骨質表型都可以分泌AKP，而AKP的表達可作為牙骨質形成過程中成骨細胞或成牙骨質細胞分化早期的標志，礦化組織的形成則可作為其分化末期的指標〔12〕。本實驗發現TW材料對于PDLFs早期促礦化的能力要優于傳統礦化誘導培養液。

綜上所述，TW材料能有效促進犬PDLFs附著增殖、分化，為后期牙周組織工程再生相關種子細胞的選擇和支架材料的構建提供理論和基礎，為口腔常見牙周病、牙列缺損缺失提供治療思路〔13〕。

4 參考文獻

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