FOXA2在肝細胞癌中的臨床意義及其與E-cadherin的相關性

陳俊任 楊定華 孫艷華 韓 慶 張敏杰

(南方醫科大學深圳市第二人民醫院肝膽外科，廣東 廣州 510515)

肝細胞癌(HCC)術后復發和轉移是導致患者預后不良的主要原因〔1〕，而上皮間質轉化(EMT)是HCC術后轉移復發的主要機制之一〔2〕。EMT發生主要表現為上皮標志物如E-cadherin和ZO-1表達減少，而間質標志物如Vimentin和N-cadherin表達增加〔3〕，研究證實E-cadherin表達缺失是HCC患者術后早期復發和預后不良的獨立預測因素〔4〕。叉頭框轉錄因子A2(FOXA2)屬于FOX基因超家族，其在調節胚胎發育過程中發揮重要作用，同時研究證實FOXA2在許多人類腫瘤中表達缺失，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌和食管癌〔5〕。最近的研究表明FOXA2表達缺失促進肺癌和胰腺癌EMT發生，抑制FOXA2導致E-cadherin表達減少，而過表達FOXA2上調E-cadherin表達水平〔6，7〕。本研究應用免疫組化技術檢測HCC及其對應癌旁組織中FOXA2與E-cadherin的表達，分析兩者表達的相關性，探討FOXA2在HCC中表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般資料 78例老年(年齡≥60歲)HCC及對應癌旁組織標本來源于2008年1月至2012年10月在我院肝膽外科接受手術的肝癌患者，所有組織標本都經患者同意后取得。患者男58例，女20例，年齡60～78〔平均(64.6±3.8)〕歲。所有標本經術后病理證實為HCC。病理分級：Ⅰ+Ⅱ級36例，Ⅲ+Ⅳ級42例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期25例。所有患者術前均未接受放、化療，本課題通過醫院倫理委員會批準。

1.2FOXA2和E-cadherin免疫組織化學染色 采用標準生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法對4 μm石蠟切片進行染色。切片在60℃烤箱中烘烤60 min，然后經二甲苯脫蠟和再水化，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)抗原熱修復，室溫冷卻20 min，0.3% Trixon-X100處理30 min，3%雙氧水-甲醇封閉內源性過氧化物酶活性，正常血清封閉非特異性結合，切片經FOXA2(1∶250，Abcam，Hong Kong)和E-cadherin(1∶400，BD Biosciences，USA)抗體4℃孵育過夜。沖洗后滴加生物素標記的山羊抗鼠二抗工作液(SP試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫孵育30 min。滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木蘇輕度復染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。細胞內棕色或棕黃色顆粒為蛋白陽性反應，FOXA2表達主要定位在細胞核，E-cadherin表達主要定位在細胞膜和細胞質，根據陽性細胞百分比進行評分：<10%=0分；10%～30%=1分；31%～50%=2分；>50%=3分，評分≥1分則認為FOXA2或E-cadherin蛋白陽性表達〔8〕。

1.3統計學方法 應用SPSS13.0軟件，分類資料采用χ2檢驗，采用Spearman秩相關檢驗。

2 結 果

2.1FOXA2和E-cadherin在HCC及對應癌旁組織中的表達 圖1可見，FOXA2和E-cadherin蛋白在HCC組織中的陽性表達率為44.9%(35/78)和52.6%(41/78)，而對應癌旁組織中兩者表達率為71.8%(56/78)和74.4%(58/78)，差異具有統計學意義(χ2=11.631，P=0.001；χ2=7.989，P=0.005)。

A：FOXA2在癌旁組織中陽性表達；B：FOXA2在HCC組織中陽性表達；C：FOXA2在HCC組織中陰性表達；D：E-cadherin在正常組織中陽性表達；E：E-cadherin在HCC組織中陽性表達；F：E-cadherin在HCC組織中陰性表達

2.2FOXA2與E-cadherin蛋白表達相關性分析 HCC組織中FOXA2與E-cadherin蛋白表達呈顯著正相關(r=0.715，P=0.015)。

2.3FOXA2蛋白表達與HCC臨床病理特征的相關性 FOXA2蛋白表達與腫瘤數目(χ2=5.552，P=0.018)、血管侵犯(χ2=9.329，P=0.002)和TNM分期(χ2=6.479，P=0.011)有關，而與性別、HBV感染、AFP水平、腫瘤大小、肝硬化和病理分級無關。見表1。

表1 FOXA2蛋白表達與HCC臨床病理參數的相關性(n)

3 討 論

HCC是最常見的肝臟原發惡性腫瘤，是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，因此探索HCC早期診斷及預測術后復發的生物標志物成為改善患者預后的關鍵〔9〕。Foxa1或者Foxa2基因敲除小鼠分別導致出生后死亡或胚胎死亡，單獨或聯合敲除Foxa1和Foxa2證實兩者對于內胚層來源細胞的終末分化和成熟十分重要，如內分泌胰腺的α細胞，肝臟、肺泡和前列腺腔導管上皮，提示FOXA1/2蛋白對于早期胚胎發育和晚或終末期上皮分化具有決定性作用〔10〕。研究證實在FOXA2在分化不良的胰腺癌中表達水平顯著低于分化良好的腫瘤，另外在FOXA2在間質型肺癌細胞中的表達水平顯著低于上皮性肺癌細胞〔6，7〕。本研究提示FOXA2與HCC的侵襲轉移能力相關，FOXA2可能作為潛在的預測腫瘤術后復發和患者生存期的分子標志物。

E鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏蛋白家族主要成員之一，負責上皮細胞與細胞之間的黏附功能，已經有研究認為鈣黏蛋白的正常功能缺失可能是腫瘤細胞去分化以及導致轉移潛能增加的重要步驟〔11〕。本研究發現E-cadherin在HCC組織中的表達水平顯著低于對應的癌旁組織，這與之前的研究報道一致〔4〕。最近研究在肺癌細胞中發現轉化生長因子(TGF-β1)能夠下調FOXA2蛋白水平，過表達FOXA2可以減少腫瘤侵襲和抑制TGF-β1誘導的細胞外基質(EMT)〔6〕。另外研究也發現FOXA1/2缺失在胰腺癌EMT過程中發揮重要作用〔7〕。E-cadherin表達減少或缺失是EMT的重要標志之一〔2〕，本研究提示FOXA2可能通過抑制EMT發揮抑制HCC轉移的功能。

綜上所述，FOXA2和E-cadherin在HCC組織中表達下調且兩者表達呈顯著正相關，FOXA2低表達與HCC惡性臨床病理特征相關，提示FOXA2可能作為HCC潛在的治療靶點。

4 參考文獻

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