“溫陽補氣”針法對EAMG大鼠神經肌肉接頭處乙酰膽堿受體表達的影響

王宇峰 張立娜 王洪峰

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

重癥肌無力(MG)是一種以神經肌肉接頭(NMJ)處傳遞功能障礙為主要病理改變的獲得性自身免疫性疾病，主要由于NMJ突觸后膜上乙酰膽堿受體(AchR)受損引起。其主要臨床表現為部分或全身骨骼肌無力和極易疲勞，活動后癥狀加重，經休息和膽堿酯酶抑制劑(ChEI)治療后癥狀減輕〔1〕。中醫學認為MG屬于“痿證”的范疇，患者以脾氣虛弱、腎陽不足為主要病機，筆者以溫陽補氣為主要治療原則，采用針灸療法治療本病取得了良好的臨床療效。為進一步研究“溫陽補氣”針法治療MG的作用機制，本研究采用國際公認的免疫接種法建立實驗性自身免疫性MG(EAMG)大鼠動物模型，觀察該針法對EAMG大鼠NMJ處AchR表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF三級Lewis大鼠80只，雌性，6～8 w齡，平均體質量(154±7.4)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號碼：SCXK(滬)2007-0005，檢疫后送至長春中醫藥大學實驗動物中心，標準大鼠顆粒飼料喂養。

1.2主要試劑和儀器 AchRα1 129-145多肽片段(美國Sigma公司)，大鼠AchR-Ab、AchR ELISA 檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司)，溴吡斯的明(60 mg/片，上海三維制藥有限公司)，艾絨(南陽綠瑩艾草生物制品有限公司)。

1.3大鼠EAMG模型建立方法 選取SPF級Lewis大鼠70只，采用免疫接種法建立EAMG大鼠動物模型。將AchRα1 129～145多肽片段按照1∶2的比例與CFA完全乳化，配比按照200 μl溶液內含有50 μg片段，不足部分用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)定容至20 ml，充分混勻制成免疫乳劑，取一滴乳劑滴入水中呈現球形而不分散為乳化好的標志。首次免疫接種時，將上述抗原乳劑以300 μl/只(含AchRα1 129～145∶75 μg)多點注射于大鼠四只足墊部、尾根部、背部。在首次免疫后第4和8周，分別進行強化免疫接種，將AchRα1 129～145多肽片段以1∶2的比例與IFA完全乳化，配比按照200 μl溶液含有50 μg片段，不足部分用PH7.4的PBS液定容至20 ml，以200 μl/只(含AchRα1 129-145：50μg)多點注射于大鼠四只足墊部、尾根部、背部。以Lennon分級評分≥1分〔2〕，同時AchR-ab為陽性為EAMG大鼠模型造模成功標準。

1.4分組及治療方法 選取建模成功的EAMG大鼠30只，隨機分為針灸治療組、藥物對照組和模型對照組，每組10只，選取同期購進未建模的SPF級Lewis大鼠10只設為空白對照組。針灸治療組予以“溫陽補氣”針法治療，手三里(雙)直刺5 mm，足三里(雙)直刺6 mm，脾俞(雙)直刺6 mm，腎俞(雙)直刺6 mm，平補平瀉，針上加灸，30 min/次，1次/d，7 d為一療程，療程間休息1 d，連續治療2個療程。藥物對照組予以溴吡斯的明灌胃治療，18.5 mg/kg/d，連續治療15 d。模型對照組和空白對照組大鼠不予特殊處置，同等條件下飼養，每日抓取1次，觀察一般情況。

1.5檢測指標及方法 大鼠NMJ處AchR表達水平的檢測：取大鼠下肢腓腸肌，立即用Warring 肌肉均漿器4℃攪拌制備勻漿，30 s/次，間隔15壁s攪拌1次，共攪拌3次；加入PBS不敷出10 ml，其中含0.4 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.4 mmol/L疊氮鈉、0.004 mmol/L苯甲基磺酰氟和2%碘化乙酰胺；然后離心12 000 r/min，4℃，30 min。取上清液，用含2%TritonX2100的PBS 15 ml重懸，再次離心。取250 μl上清液(粗提AchR) 加2 nmol/L 125I-aBT和鼠抗AchR IgG，4℃包被24 h，然后加羊抗鼠血清4℃，4 h后離心洗滌于r 計數儀中計數，將標本放于-20℃條件下保存，檢測前在室溫下均勻解凍。之后采用ELISA法測定EAMG大鼠神經肌肉接頭處AchR的含量，具體方法按說明書操作。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

表1可見，EAMG大鼠動物模型造模成功后，模型對照組EAMG大鼠神經肌肉接頭處AchR表達水平顯著降低，與空白對照組比較具有極顯著性差異(P<0.01)，證明AchR在EAMG的發病過程中發揮了重要的作用；經治療后，針灸治療組和藥物對照組EAMG大鼠AchR的表達水平均明顯提高，與模型對照組相比均具有顯著性差異(P<0.01)，證明“溫陽補氣”針法和溴吡斯的明對EAMG大鼠經肌肉接頭處AchR的表達水平均具有較好的調整作用；針灸治療組與藥物對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，說明“溫陽補氣”針法與溴吡斯的明對EAMG的治療效果相近。

表1 各組大鼠腓腸肌神經肌肉接頭處AchR表達水平±s,pg/μl)

3 討 論

AchR-ab與NMJ突觸后膜的AchR特異性結合，加速AchR的降解，導致突出后膜上AchR數量減少，阻礙了神經電信號的傳導是MG產生的主要原因〔3,4〕。國內學者關兵峰等〔5〕研究顯示，MG患者的胸腺瘤組織中煙堿型AchR(nAchR)蛋白表達低于胸腺增生組織；胸腺萎縮組織中nAChR蛋白的表達也低于正常對照組。陸天宇等〔6〕通過AChR亞基在老年MG患者中的表達中發現，胸腺瘤及胸腺中可以檢測到AChR的5個各亞單位，胸腺瘤中AChR各亞單位灰度值/內參灰度值均低于肌肉組織，MG肌肉AChR亞單位中除γ亞單位外，均高于正常肌肉亞單位，上述研究結論均證明AchR的表達水平增高與MG的發病存在著密切的聯系。

國內中醫學專家〔7～9〕認為MG患者多以虛證為主，其病位主要在脾腎二臟，其病機主要為脾胃虛弱致氣血化生乏源，或腎陽不足至精血虧虛，以致筋肉失于濡養，久之導致機體頹痿無力。“溫陽補氣”針法根據MG患者脾氣虛弱，腎陽不足的主要病機，取手陽明經穴之手三里，取足陽明經穴之足三里，堅持了“治痿獨取陽明”的治療原則；同時，脾為“后天之本”、“氣血生化之源”，腎為“先天之本”，故取脾俞、腎俞兩穴，通過溫補“先天之本”，健運“后天之本”，以調節脾腎二臟之虛弱不足，達到了溫陽補髓、益氣養血、濡潤宗筋，補氣助力、壯肌治痿的治療目的。課題組通過前期的研究工作證實〔10〕，“溫陽補氣”針法可以通過調節EAMG大鼠血清中轉化生長因子(TGF)-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達水平而發揮治療作用。通過本研究可進一步發現：“溫陽補氣”針法可以促進EAMG大鼠NMJ處AchR表達水平的增高，增加NMJ突出后膜上AchR的數量，促進神經電信號的傳導，從而達到治療MG的作用。

4 參考文獻

1Jayam TA,Dabi A,Solieman N,etal. Myasthenia gravis: a review 〔J〕. Autoimmune Dis,2012;2012:874680.

2Lennon VA,Lindstrom JM,Seybold ME. Experimental autoimmune myasthenia:a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigs 〔J〕.J Exp Med,1975；141(6): 1365-75.

3Le Panse R,Berrih-Aknin S. Autoimmune myasthenia gravis: autoantibody mechanisms and new developments on immune regulation 〔J〕. Curr Opin Neurol,2013；26(5): 569-76.

4Shen C,Lu Y,Zhang B,etal. Antibodies against low-density lipoprotein receptor-related protein 4 induce myasthenia gravis 〔J〕. J Clin Invest,2013;123(12): 5190-202.

5關兵峰,崔新征,方 華,等.重癥肌無力患者胸腺組織中膽堿乙酰轉移酶和煙堿型乙酰膽堿受體的表達〔J〕.鄭州大學學報:醫學版,2012;47(3): 299-302.

6陸天宇,王泳心,崔有斌.乙酰膽堿受體亞基在老年重癥肌無力合并胸腺瘤患者中的表達〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(8): 1785-7.

7鄧中廣,邱仕君.鄧鐵濤對重癥肌無力的認識與辨證論治〔J〕.中國醫藥學報,1993;8(2): 41-23.

8王 玨.裘昌林治療重癥肌無力的經驗〔J〕. 浙江中醫雜志,2004;39(6):238-9.

9周俊亮.劉友章教授診治重癥肌無力的臨床經驗介紹〔J〕.現代中西醫結合雜志,2004;13(23):3107-8.

10王洪峰,吳 瑤,張立娜.“溫陽補氣”針法對EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(23):5884-5.