pcIL-18-MAGE-1共表達基因疫苗對肝癌細胞株SMMC-7721、Hepal-6增殖的影響

齊亞靈 孟德欣 楊廣民 周曉紅 李艷君 楊 宇 譚 巖

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154002)

腫瘤的形成是由于各種致癌因素引起DNA損傷，從而激活原癌基因和(或)滅活抑癌基因；或者凋亡調控基因和(或)DNA修復基因發生改變，進而引起基因表達異常。基因疫苗是將編碼抗原的基因片段克隆到真核表達質粒，將該質粒免疫動物，致使編碼抗原的基因片段在宿主體內表達，刺激機體產生免疫應答，誘導腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷腫瘤。本文觀察pcIL-18-MAGE-1共表達基因疫苗免疫后小鼠脾細胞誘導的腫瘤特異性 CTL 對肝癌細胞株SMMC-7721、Hepal-6的殺傷作用，探究pcIL-18-MAGE-1共表達基因疫苗抗腫瘤作用。

1 材料和方法

1.1細胞株、質粒、實驗動物 質粒 pcDNA3、pcIL-18-pcMAGE-1、肝癌細胞株SMMC-7721和Hepal-6為吉林省人民醫院腫瘤生物治療中心提供。清潔級雌性C57BL/6J小鼠(中國醫學科學院實驗動物研究所)，體重(20±2)g，自由食水，無菌動物室飼養。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、IMDM 細胞培養液、淋巴細胞分離液、MTT、DMSO、3%氫氧化鋁(武漢博士德公司)。FITC與PE標記的羊抗鼠CD4+、CD8+單抗、FITC標記的羊抗鼠IgG單抗(美國Immunotech公司)。流式細胞儀(FCM)(美國BD公司)、HF240二氧化碳培養箱(上海斯高勒生物科技有限公司)。

1.3實驗分組及免疫方法 將30只C57BL/6J小鼠隨機分為3組各10只。疫苗免疫組肌注100 μg pcIL-18-pcMAGE-1(0.4 ml 3%氫氧化鋁膠)；空白對照組肌注等量生理鹽水；陰性對照組肌注等量空質粒pcDNA3。注射部位：小鼠大腿內側肌群。每隔10 d注射1次，共3次。末次注射7 d后，斷頭處死小鼠，將取出的脾臟浸入含 10%胎牛血清的IMDM細胞培養液中研磨，用200目濾網過濾，收集脾細胞懸液于玻璃試管中備用。

1.4小鼠T細胞亞群及自然殺傷(NK)細胞活性檢測 每組分別取1×106個小鼠脾細胞，0.1 mol/L PBS洗2次，分別加入單抗10 μl，室溫避光，20 min。PBS洗2次，加0.5 ml PBS混勻，10 min后，FCM檢測。

1.5小鼠脾細胞CTL活性測定 將SMMC-7721細胞及Hepal-6細胞分別加入到96孔板中，每孔1×104個細胞，同時取陰性對照組及疫苗免疫組的1×106個效應脾細胞分別加入到上述96孔板中，每組設3個復孔。37℃、5%CO2培養箱孵育過夜；棄掉培養基，每孔加50 μl 0.5 mg/ml MTT，37℃、5%CO2培養箱孵育4 h，棄上清，每孔加100 μl DMSO，酶標儀測570 nm處的吸光值(OD值)。殺傷率(%) = 〔1- (效應細胞+靶細胞)OD值-效應細胞OD值/靶細胞OD值〕×100%。

1.6統計學分析 使用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1T細胞亞群及NK細胞活性檢測結果 與兩個對照組比較，疫苗免疫組脾細胞中CD4、CD8 T細胞比例及CD4/CD8比值、NK細胞活性顯著增高(P<0.01，P<0.05)。陰性對照組與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.2免疫小鼠脾細胞對肝癌SMMC-7721細胞及Hepal-6細胞殺傷率 共表達pcIL-18-pcMAGE-1基因疫苗對SMMC-7721細胞及Hepal-6細胞均具有顯著抑制性，與對照組比較，差異顯著，且對SMMC-7721細胞殺傷率明顯高于Hepal-6細胞(P<0.05)，見表2。

表1 各組CD4、 CD8、CD4/CD8及NK細胞值比較(n=10，±s,%)

表2 各組脾細胞對SMMC-7721和 Hepal-6細胞殺傷率(n=3，±s，%)

3 討 論

基因疫苗是近10年發展起來的新型疫苗，又叫核酸疫苗或DNA疫苗，目前基因疫苗的研究已涉及病毒、支原體、衣原體、寄生蟲、螺旋體、細菌以及癌癥等諸多領域，一些基因疫苗的研究已處于Ⅰ、Ⅱ期臨床研究階段。基因疫苗與常規的滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及重組疫苗相比，具有安全、有效、制備容易、保存運輸方便等優點。眾多學者的實驗結果表明，MAGE-1基因、蛋白在多種惡性腫瘤組織中高表達，而在正常組織中不表達〔1～4〕，并且MAGE-1是用T細胞毒方法鑒定的第一個人類腫瘤抗原〔5〕，MAGE被認為是免疫原性最強的腫瘤抗原之一〔6〕，目前，MAGE-1的腫瘤疫苗已進入臨床試驗，在一些腫瘤的治療中取得較好的療效〔6〕。

白細胞介素(IL)-18能夠增強NK 細胞的活性，促進 Th1、NK 細胞增殖。IL-18 可產生有效的免疫調節作用，是一種良好的免疫佐劑〔7，8〕，CD4 T為輔助性T細胞，CD8 T為殺傷性T細胞。由此可以推斷，pcIL-18-pcMAGE-1共表達基因疫苗通過提高CD4 T比值，對C57BL/6J小鼠MAGE-1抗體生成、巨噬細胞活化、NK細胞活化及CTL的活化有輔助、放大效應，并通過它們發揮免疫作用；通過提高CD8 T比值，增加C57BL/6J小鼠NK細胞活性，促進效應細胞的殺傷功能。并且誘導腫瘤特異性 CTL直接殺傷腫瘤細胞，發揮抗腫瘤作用。因此，制備以 MAGE-1 抗原為靶點、以IL-18為佐劑pcIL-18-pcMAGE-1基因疫苗通過提高機體免疫功能，促進NK細胞活性，誘導腫瘤特異性 CTL，產生廣譜抗腫瘤免疫效應，避免了單一腫瘤疫苗只針對一種腫瘤的局限，具有良好的臨床應用前景。

4 參考文獻

1Xu LF，Zhu J，Jiao YJ，etal. Expression and characterization of MAGE-1 gene from human hepatocellular carcinoma cells〔J〕.ACTA universitatis medicinalis Nanjing，2006；26(7)：534-37.

2劉 寧，梁 寒，李 強,等.MAGE-1、MAGE-3及AFP基因在肝癌組織中的表達〔J〕. 中國腫瘤臨床，2007；34(9)：493-6.

3Yuasa T，Okamoto K，Kawakami T，etal. Expression patterns of cancer testis antigens in testicular germ cell tumors and adjacent testicular tissue〔J〕. J Urol，2001；165(5)：1790-4.

4楊 安. MAGE-1 和 SCP-1 在胃癌中的表達及相關性研究〔J〕.現代腫瘤醫學，2014；2(3)：585-7.

5Vander BP，Traversari C，Chomez P，etal.Agene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on human melanoma 〔J〕. Science,1991；254(5038): 1643-7.

6Zhao Y，Zheng Z，Khong HT，etal．Transduction of an HLA-DP4-restricted NY-ESO-1-specific TCR into primary human CD4+lymphocytes〔J〕.J Immunother，2006;29(4)：398.

7Hart G，Flaishon L，Shachar I. IL-12 and IL-18 down-regulate B cell migration in an Ly49D-dependent manner〔J〕. Eur J Immu，2007；37(7)：1996-207.

8時 陽，楊廣民，李首慶,等.MAGE-1與IL-18共表達DNA疫苗的構建與體外表達〔J〕. 中國老年學雜志，2007；27(19)：1865-8.