哮喘小鼠C7-T5節段脊髓后角Kinesin-1的表達

張寶輝 方秀斌 劉曉湘

(中國醫科大學神經生物學教研室，遼寧 沈陽 110001)

支氣管哮喘發病機制復雜，多種細胞因子在氣道炎癥發展過程中起重要作用。驅動蛋白(Kinesin)-1在膜性細胞器的運輸、有絲分裂、減數分裂、信號轉導、微管多聚體的動力學控制、mRNA和蛋白質的運輸等方面起著重要作用〔1〕，人類的多種疾病都表現出了驅動蛋白表達異常。研究發現，在人體內，驅動結合蛋白基因的5’端融合到ret基因表達酪氨酸激酶的區域，能夠導致甲狀腺細胞癌變〔2〕；有研究報道，驅動結合蛋白是白塞病(BD)的相關抗原，因此抗驅動結合蛋白抗體與BD發病機制密切相關，值得深入探索〔3〕。Fridolfsson等〔4〕研究表明驅動結合蛋白可能是再生障礙性貧血病人的自身抗原之一。但是，Kinesin-1在哮喘小鼠C7～T5節段脊髓后角內的表達是否發生變化尚未見文獻報道。本研究擬探討采用免疫熒光和Western印跡方法檢測各組小鼠C7～T5節段脊髓后角內kinesin-1的表達變化。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組及模型制備 雌性BALB/c小鼠20只，由首都醫科大學實驗動物中心提供。按隨機數字表法分為:(1)哮喘組10只，第1天每只小鼠腹腔注射20 μg卵蛋白(OVA)(Sigma公司)和2 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，第8天、15天每只小鼠腹腔注射10 μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，第16天開始將小鼠置于封閉容器中，給予4% OVA(PBS配成)霧化吸入激發哮喘發作，每天1次，25 min/次，連續7 d。 (2)正常對照組，以PBS代替OVA注射和霧化吸入，其余均與哮喘組相同。各組最后一次激發后24 h處死。

1.2AniRes2005肺功能儀測氣道反應性 用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(80 mg/kg)，疼痛反射消失后固定在小鼠體描箱內操作臺上，氣管插管，呼吸比15∶10，呼吸頻率90次/min，游離頸外靜脈，行靜脈穿刺，固定針柄，封閉體描箱。乙酰甲膽堿(mAch)用磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH 7.4)配成0.025、0.05、0.075、0.1 mg/kg經頸外靜脈各注射0.1 ml，記錄波形和數據。

1.3免疫熒光 動物用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg體重)，用4%多聚甲醛灌流固定，將組織后固定24 h，移入30%蔗糖緩沖液中致標本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機連續切片(片厚8 μm)。冷風干燥后，室溫下血清封閉20 min，甩干，滴加一抗-1(購自Santa Cruz公司)工作濃度為1∶150，4 ℃孵育過夜；PBS充分洗滌，滴加工作濃度為1∶100 FITC標記的二抗(購自Sant Crutz公司)，孵育40 min；PBS充分洗滌，甘油封片，用OlympusBX51型熒光顯微鏡進行觀察。綠色熒光為陽性表達。

1.4Western免疫蛋白印跡 動物用0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)，取C7～T5節段脊神經，置于裂解液中機械勻漿，4 ℃ 17 000 r/min離心1 h，吸出上清液，棄去沉淀。用考馬斯亮藍G250結合法，根據已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算出樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質變性。將制備好的樣品置于-20 ℃冰箱備用。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4 ℃過夜。一抗Kinesin-1及β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標記羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000,Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑(Santa Cruz)反應1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統上攝像分析，測得目標帶的MOD，進而計算出各組樣品目標帶的MOD與內參照β-actin MOD的比值。

1.5統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1哮喘模型制作結果 正常對照組霧化吸入生理鹽水后無明顯哮喘反應，哮喘組動物在霧化吸入OVA 3次后，大部分哮喘發作，表現為呼吸頻率加深加快，肋間隙凹陷，刺激性嗆咳，表明模型制作成功。

2.2AniRes2005肺功能儀測氣道阻力 哮喘組小鼠對mAch的濃度反應曲線明顯上移，其呼氣阻力(ER)和吸氣阻力(IR)顯著高于正常對照組(P<0.01)，表明哮喘小鼠對mAch的氣道反應性顯著高于正常小鼠，哮喘模型建立成功(圖1)。

2.3免疫熒光結果 從哮喘組小鼠C7～T5節段脊髓的免疫熒光圖片上可以看到較強的Kinesin-1的熒光表達，而正常組小鼠C7～T5節段脊髓的免疫熒光表達較弱(圖2)，說明Kinesin-1的陽性表達較少;圖像分析結果表明，哮喘組小鼠Kinesin-1蛋白的熒光表達平均光密度值為(28.22±2.95),正常組小鼠為(16.11±2.03),二者平均光密度值差異顯著(P<0.01)。

圖1 AinRes 2005 肺功能儀測氣道阻力

圖2 免疫熒光檢測C7-T5節段脊髓組織KLC-1表達

2.4Western印跡結果 對Western印跡結果進行分析光密度值分析，哮喘組小鼠Kinesin-1蛋白表達的MOD值與內參照β-actin的MOD比值為(0.32±0.01),正常對照組小鼠Kinesin-1蛋白表達的MOD值與內參照β-actin的MOD比值為(0.17±0.01),二者相比，平均光密度值差異顯著(P<0.01)。見圖3。

3 討 論

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的反復發作的可逆性的氣流受限和氣道高反應性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，我國哮喘發病率為1%，其中兒童達3%。近年來支氣管哮喘與細胞信號傳導的研究一直受到國內外學者的普遍關注。越來越多的研究發現哮喘發生不僅僅與免疫炎癥相關,同時神經系統也參與了哮喘的發病。但對于他們之間的相互作用及其機制尚不完全清楚。

驅動蛋白是一種典型的分子馬達，由頭部、頸部和尾部區域組成，在細胞內以微管為軌道運動。驅動蛋白的頭部由兩條相同的鏈組成，每條重鏈的一端由約340個氨基酸折疊成球狀,它是馬達與微管蛋白結合和催化ATP水解的部位。其余部分相互盤繞成雙股的α螺旋。鏈的末端結合的輕鏈，稱為驅動蛋白的尾部,用來連接要運送的細胞器，頸部有兩個,它們連接在馬達域上,并且可以伸屈〔5，6〕。近年研究發現囊泡轉運離不開細胞骨架的參與,細胞骨架為囊泡轉運提供了軌道，而位于細胞骨架表面的驅動結合蛋白，與囊泡存在相互作用，驅動蛋白能夠催化水解ATP為二磷酸腺苷(ADP)和無機磷酸(Pi)，將貯藏在分子中的化學能高效地轉化為機械能，產生定向運動，介導囊泡沿微管向正極的運動〔7，8〕。囊泡轉運可以實現細胞從胞外獲得營養物質,以及胞內的物質轉運,可將營養物質輸送到細胞各處,并確保功能蛋白準確發揮效用，其功能紊亂會導致多種疾病的發生。而在神經元中，軸突末端到細胞體的距離很長,并且軸突末梢要釋放大量的神經遞質,所以神經元必須不斷合成、供給大量的物質,包括蛋白質、膜,以補充因軸突部位的胞吐而喪失的成分。由于核糖體只存在于細胞體和樹突中,所以蛋白質必須在細胞體中合成，然后通過順向轉運轉移到軸突。軸突的物質也可通過逆向轉運轉移到胞體，實現細胞內的物質循環，一旦這一循環遭到破壞，就會引發嚴重疾病。研究發現，tau纖維絲可以選擇性抑制驅動蛋白介導的順向快速軸突轉運(FAT),并引起驅動蛋白與囊泡的解離,使軸突運輸發生了障礙,重要物質無法運輸到軸突末梢，影響軸突末梢與胞體的交流,致使突觸功能失調，導致神經元死亡〔9〕。但是，在哮喘發病機制中，驅動蛋白是否出現功能異常尚未見文獻報道。

4 參考文獻

1Vale RD，Milligan RA.The way things move：looking under the hood of molecular motor proteins〔J〕.Science,2000;288(5463)：88-95.

2Cho K,Yi H,Desai R,etal.RANBP2 is an allosteric activator of the conventional kinesin-1 motor protein,KIF5 B,in a minimal cell-free system〔J〕.EMBO J,2009;10(5):480-6.

3Wong YL,Dietrich KA,Naber N,etal.The kinesin-1 tail conformationally restricts the nucleotide pocket〔J〕.Biophys J,2009;96:2799-807.

4Fridolfsson HN,Ly N,Meyerzon M,etal.UNC-83 coordinates kinesin-1 and dynein activities at the nuclear envelope during nuclear migration〔J〕.Dev Biol,2010;338(2):237-50.

5DeBoer SR,You YM,Szodorai A,etal.Conventional kinesin holoenzymes are composed of heavy and light chain homodimers〔J〕.Biochemistry,2008;47(15):4535-43.

6Dietrich KA,Sindelar CV,Brewer PD,etal.The kinesin-1 motor protein is regulated by a direct interaction of its head and tail〔J〕.PNAS,2008;(105)26:8938-43.

7Araki Y,Kawano T,Taru1 H,etal.The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport〔J〕.EMBO J,2007;26:1475-86.

8Fridolfsson HN,Starr DA.Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei〔J〕.J Cell Biol,2010;191(1):115-28.

9LaPointe NE,Morfini G,Piqino G,etal.The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport :implications for filament toxicity〔J〕.J Neurosci Res,2009;87:440-51.